大肠杆菌耐利福定突变基因的克隆及限制性酶切谱分析

被引：1

作者：

段传可，王浴生，强文安，李良宏

机构：

[1] 华西医科大学基础医学院

来源：

中国抗生素杂志 | 1995年 / 03期

关键词：

利福定，pBR322，琼脂糖凝胶电泳，pBD802;

D O I：

10.13461/j.cnki.cja.001833

中图分类号：

R978.3 [抗结核病药、抗麻风病药物];

学科分类号：

1007 ;

摘要：

采用利福定（ｒｉｆａｎｄｉｎｅ，ＲＦＤ）浓度梯度平皿筛选得４株耐ＲＦＤ大肠杆菌（ＲＦＤ的ＭＩＣ为５００μｇ／ｍｌ），连续传两代其耐药性保持稳定；对４株耐ＲＦＤ大肠杆菌，采用酚—氯仿法，酚—透析法和蛋白酶Ｋ—　玻棒缠绕法提取其总ＤＮＡ和采用煮沸法、　碱法提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果均未见质粒ＤＮＡ带。　提示所试菌株的耐药系突变耐药，由染色体介导。对耐ＲＦＤ　大肠杆菌２２８０，用蛋白酶Ｋ—玻棒缠绕法提取其染色体ＤＮＡ，并选Ｂｇ１Ⅱ完全酶切，获许多大小不等的ＤＮＡ片段，然后与碱法提取的ＢａｍＨＩ　酶切的载体质粒ｐＢＲ３２２（ＡＭｐｒ、ＴＣｒ失活，４．ｓｋｂ）用Ｔ４－ＤＮＡ连接酶连接，重组体再向感受态大肠杆菌ＨＢ１０１转化，最后在含ＲＦＤ５０μｇ／ｍｌ，ＡＭＰ６０μｇ／ｍｌ的选择性ＬＢ琼脂平板上筛选获得了携有耐ＲＦＤ突变基因重组＊质粒ｐＢＤ８０２的菌落。检测ＲＦＤ的ＭＩＣ为５１２μｇ／ｍｌ，琼脂糖凝胶电泳显示其耐ＲＦＤＤＮＡ片段的大小约１６ｋｂ。选ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＨｐａⅠ、ＥｃｏＲⅤ、ＳａｌⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｌⅡ、ＰｓｔⅠ８种限制性内切酶对ｐＢＤ８０２进行完全酶切，分析了其限制性酶切电泳图谱特征

引用

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