Caspase 3 siRNA抑制关节软骨细胞的凋亡

背景:到目前为止,国内外对caspase 3抑制剂的研发大都集中在肽类或非肽类化合物的合成和发现上,而利用RNAi干扰技术直接沉默caspase 3基因,在基因水平抑制软骨细胞凋亡还未见报道。目的:利用慢病毒载体,把Caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使其caspase 3基因沉默,相对阻断凋亡效应的联级反应,期望达到抵抗软骨细胞凋亡的目的。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/2009-06在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所完成。材料:软骨细胞从SPF级SD大鼠关节中提取,caspase 3 siRNA慢病毒载体为实验构建。方法:构建大鼠pSIH1-H1-copGFP-Caspase 3 siRNA表达质粒,使用慢病毒包装系统,在293TN细胞中进行包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒,然后转导(transduce)入大鼠软骨细胞。主要观察指标:实时荧光定量-聚合酶链反应和Westernblot检测转导后软骨细胞caspase 3基因沉默情况,再用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡,流式细胞技术AnnexinV/PI检测软骨细胞凋亡情况。结果:Caspase 3 siRNA能顺利转入软骨细胞,转导率达90%;实时荧光定量-聚合酶链反应检测软骨细胞中Caspase 3mRNA的表达量,实验组低于与对照组差异有显著性(P<0.01);Western blot检测软骨细胞的Caspase 3蛋白表达量,实验组低于与对照组差异有显著性意义(P<0.01);在使用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡时,caspase 3 siRNA转导组抑制细胞凋亡的能力是对照组的7倍。结论:利用慢病毒载体把caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使软骨细胞的caspase 3基因沉默,可以达到相对拮抗软骨细胞凋亡的目的。