多重实时PCR对宫颈癌组织及SiHa细胞株HPV-16病毒存在状态的检测

背景与目的:人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染与宫颈癌发生发展密切相关,高危型HPV病毒整合入宿主细胞是细胞转化及癌变的关键。病毒整合状态的检测对深入探讨宫颈癌发生发展机制及预测宫颈病变的转归有一定的临床意义。然而目前尚没有一种理想的能够用于各种临床标本的HPV存在状态的检测方法。本研究旨在探讨HPV-16存在状态的理想检测方法。方法:以HPV-16质粒为标准品,利用两种不同的荧光报告基团,采用多重实时PCR同管定量检测HPV-16E2和E6基因,根据E2和E6基因拷贝数的比值(E2/E6)来判定HPV-16的存在状态;对HPV-16阳性的宫颈癌SiHa细胞和27例宫颈鳞癌新鲜标本进行多重实时PCR与Southern杂交检测,将两种检测方法的结果进行比较。结果:(1)多重实时PCR所得到的HPV-16E2、E6标准曲线相关性好,相关系数均为1.00,扩增效率均在95%以上。(2)对系列稀释的HPV-16质粒进行重复检测,确定了E2/E6比值为1时该多重实时PCR检测系统的95%参考值范围为0.81～1.29,以0.81作为区分游离型和混合型HPV-16的界值。(3)多重实时PCR与Southern杂交检测均发现SiHa细胞中HPV-16呈整合型,27例鳞癌中22例获得了一致的检测结果,符合率为81.5%,Kappa值为0.844,P<0.001。结论:多重实时定量PCR是一种可靠的、便于临床应用的检测HPV-16病毒存在状态的方法,具有省时、简便快速、高通量的优点,并且能用于石蜡切片以及病灶较小、DNA含量少的宫颈癌前病变组织或宫颈细胞学标本。