兔原代肋软骨细胞的三步酶消化法高效分离及体外培养观察

目的观察三步酶消化法分离兔原代肋软骨细胞的效果和收获效率,并观察其体外传代培养的生物学特性。方法三步酶消化法设计为以培养液配制的1 g/L胰蛋白酶/1 g/L EDTA、1 g/L透明质酸酶和2 g/LⅠ型胶原酶顺序消化肋软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化。结果①肋软骨经三步酶消化软骨基质逐步解离和降解,细胞被完全分离,每克软骨的细胞收获量平均为4 295.7×104个细胞,细胞存活率平均为97.2%。②原代和第1代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(80.61±11.40)μg/cm2;第3代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应亦明显减弱,第4代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(44.74±10.18)μg/cm2。结论①三步酶消化法能完全消化降解肋软骨基质,使细胞完全分离,并具有高细胞收获率和高细胞存活率。②原代和第1代肋软骨细胞具有良好的生物学活性。