钩端螺旋体外膜蛋白LipL32的重组表达及在ELISA检测中的初步应用附视频

目的 构建1.32-pQE32重组质粒,诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32,建立以重组外膜蛋白为基础的抗体间接ELISA检测方法。方法 采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段,构建重组克隆载体pGEM-T/L32和表达载体L32-pQE32,转化受体菌E.coliDH5α和E.coliM15,IPTG诱导表达重组LipL32蛋白。Ni-NTA亲和层析纯化重组LipL32蛋白。以纯化的重组LipL32蛋白为抗原,特异的钩体抗血清进行ELISA实验。结果扩增出约750bp的LipL32成熟蛋白基因,LipL32基因插入pQE32表达载体,表达产物6个组氨酸与LipL32蛋白的融合蛋白相对分子量约为31kDa。与预期27.6kDa大小一致。SDS-PAGE电泳显示:LipL32蛋白主要以包涵体形式表达。ELISA显示Li-pL32蛋白能与钩体抗血清特异结合。方阵滴定试验确定以100ng/孔包被酶标板,酶标抗体稀释度1:20 000作为工作浓度。结论LipL32蛋白能在大肠杆菌中表达,Ni-NTA亲和层析可有效纯化重组LipL32蛋白,重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。