大鼠丙酮酸激酶同工酶催化性质的比较研究

利用DEAE纤维素柱层析分离大鼠组织匀浆105,000g上清中的丙酮酸激酶(PyK)同工酶,发现肝和肾中存在L及K两型PyK,肝中以L型为主,而肾中以K型较多,L:K的平均活性比值分别为6.07及0.248。但骨胳肌中只有M型。用聚丙烯酰胺凝胶板电泳也可获得相似的同工酶谱。用硫酸铵沉淀结合层析又从大鼠红细胞中提取了R型PyK,与上述三型一起,进行了催化性质的比较研究。结果如下: 1.K型对热极不稳定,而M型对热最为稳定。2.L型和K型可利用GDP代替ADP作为底物,但GDP作为底物时的酶活性远小于ADP作底物时的活性。M型利用GDP的能力很小,而R型几乎可忽略不计。3.某些氨基酸可抑制PyK,K型PyK对氨基酸的抑制最为敏感,可使其抑制的氨基酸最多,而M型最不敏感,在测定的12种氨基酸中仅受苯丙氨酸抑制,L型与R型介于上述两型之间,可使它们抑制的氨基酸种类相似。4.氨基酸对PyK的抑制作用与它们代谢途径中成糖或成酮的关系尚不明确,而与其结构有密切关系。能抑制PyK的氨基酸主要是非极性氨基酸,如丙、正丁、脯、苯丙氨酸等,当这四种氨基酸的侧链羟化成相应的丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或酪氨酸后,其抑制作用明显减弱或消失。5.小侧链的脂肪族氨基酸(如半胱、丙、正丁)对L型PyK的抑制作用强于大侧链的芳香族氨基酸(苯丙、酪);但对K型PyK的抑制却弱于大侧链芳香族氨基酸。并且L型对小侧链氨基酸的敏感性大于K型,而对大侧链氨基酸的敏感小于K型。6.丙氨酸对L、R、K三型PyK的抑制作用与其α-氨基和直链结构有密切关系,其中α-氨基尤为重要。7.果糖-1,6-二磷酸(FDP)能激活R及K型PyK,当底物PEP处于低浓度时,尚可激活L型。FDP还能逆转各种氨基酸对四型PyK同工酶的抑制作用,其中对R及K型的逆转效果较大。FDP对各种氨基酸抑制的逆转效应并不相同。8.丝氨酸可显著激活K型PyK,也可逆转氨基酸对K型PyK的抑制作用,其逆转效率仍因氨基酸而异,但其激活作用与FDP不能相加。对上述结果作了讨论,认为这些PyK同工酶催化性质的差异可有助于鉴定未知样品中的同工酶类型。还提出一个PyK同工酶上有两类氨基酸结合点的假说。