2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究

目的建立2型糖尿病血瘀证的血管内皮细胞损伤模型。方法取对数生长期的正常人脐静脉内皮细胞(ECV-304),干预分组如下:空白对照组(无血清的DMEM)、健康组(健康人血清)、糖尿病血瘀证组(糖尿病血瘀证患者血清)和糖尿病非血瘀证组(糖尿病非血瘀证患者血清)。采用MTT法观察细胞活性;在倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜下观察细胞形态的变化;应用放免法测定内皮素(ET)含量;硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量;利用双抗夹心ELISA法检测各组细胞培养上清液中内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、血管内假性血友病因子(vWF)和血栓调节蛋白(sTM)的含量;应用激光扫描共聚焦显微镜,采用Fluo-3/AM作为荧光指示剂观察细胞内游离钙浓度的变化;并采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞肌动蛋白微丝分布的差异。结果①10%浓度的糖尿病血瘀证组的OD值较健康组明显降低(P<0.001);②糖尿病血瘀证组的ET水平比空白对照组和糖尿病非血瘀证组升高(P<0.001);糖尿病血瘀证组的NO水平比空白对照组降低(P<0.001);但和糖尿病非血瘀证组相比差异没有统计学意义(P>0.05);③内皮细胞经过患者血清损伤后,糖尿病血瘀证组分泌的EPCR含量比空白对照组升高(P<0.001),但低于糖尿病非血瘀证组(P<0.001);糖尿病血瘀证组分泌的vWF和sTM含量比空白对照组升高(P<0.001),和糖尿病非血瘀证组相比差异没有统计学意义(P>0.05);④糖尿病血瘀证组胞浆内荧光分布不均匀,荧光强度高于正常对照组和糖尿病非血瘀证组(P<0.001);⑤空白对照组和健康组细胞骨架微丝分布多规则清晰,保持着细胞的正常外形,糖尿病血瘀证组的细胞骨架微丝断裂且排列紊乱,糖尿病非血瘀证组细胞微丝断裂但排列较为规则。结论应用2型糖尿病血瘀证患者血清干预ECV-304可以在体外表现出血管内皮细胞损伤的种种征象,初步建立一种病证结合的血瘀证细胞损伤模型。