TaqManTM实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的初步研究

目的:建立实时荧光TaqM anTM定量检测蜡样芽胞杆菌的快速检测方法,为食品中蜡样芽胞杆菌污染的调查及食物中毒的快速准确定量检测提供手段。方法:通过分析蜡样芽胞杆菌16S rDNA、23S rDNA、16S-23S ITS、gyrB、groEL、cereolysin AB、HBL(hb lA、hb lC、hb lD)、NHE(nheA、nheC、nheD)、bce-T等目的基因,对比所选取的不同目的基因优缺点,最终选择合适的目的基因16S-23S ITS进行同源性分析,并根据GenBank公布的蜡样芽胞杆菌16S-23S ITS基因的保守序列,用引物与探针专业设计软件自行设计引物和TaqM anTM探针,并利用硅胶模型TM基因组DNA提取法制备DNA标准品,通过对TaqM anTM实时荧光PCR退火温度、探针浓度、引物浓度、Mg2+离子浓度、缓冲液浓度及酶用量等反应条件的优化,初步建立蜡样芽胞杆菌的实时荧光TaqM anTM快速定量检测方法,并利用该方法对模拟样品进行检测。结果:选取的16S-23S ITS基因同源性达到99%以上,特异性好;所有蜡样芽胞杆菌均含有两段16S-23S ITS基因,有利于提高反应的灵敏度。通过对各实验条件的优化,得出蜡样芽胞杆菌TaqM anTM实时荧光PCR的最佳反应条件,初步建立起实时荧光TaqM anTM定量检测蜡样芽胞杆菌的快速检测方法,该方法能在3 h左右完成整个检测过程。结论:实时荧光Taq-M anTM定量检测法不但灵敏度好,而且特异性高,检测时间短,能提高蜡样芽胞杆菌的检出率和检测准确性,可望应用于蜡样芽胞杆菌食物中毒的快速准确定量诊断。