Twist基因转染对人宫颈癌细胞生物学行为影响的观察

目的:构建人Twist基因真核表达载体,并建立稳定高表达Twist的人宫颈癌HCC94细胞系,研究转染前后HCC94细胞生物学行为。方法:用RT-PCR法扩增人低分化宫颈癌HCE1细胞中Twist开放阅读框架,将PCR产物克隆到pZsGreen-C1真核表达载体,构建重组质粒pZsGreen-C1/Twist并鉴定。采用脂质体法把重组载体转染入人高分化宫颈癌HCC94细胞,经G418筛选获得稳定高表达Twist的细胞克隆,并进行荧光,蛋白质印迹法和Realtime RT-PCR检测;MTT法和侵袭小室实验研究转染前后HCC94细胞的增殖、黏附和迁移能力。结果:成功构建pZsGreen-C1/Twist真核表达载体,筛选出稳定高表达人Twist的p-tw-1克隆,经荧光显微镜观察其转染效率>70%。Realtime RT-PCR扩增曲线和熔点曲线显示,Twist基因有效扩增,p-tw-1组、p-tw-v(转染空载体)组和HCC94(未转染)组mRNA相对表达量分别为4.14±2.26、2.03±1.10和1.90±0.78,p-tw-1组相对于其他两组水平明显上调,差异有统计学意义,F=10.24,P=0.001;而对照组之间差异无统计学意义,P=0.146。蛋白质印迹法检测结果显示,Twist基因稳定表达,p-tw-1组、p-tw-v组和HCC94组IOD与GAPDH比值分别为0.65、0.33和0.30。p-tw-1组细胞从第4天起生长趋势快于p-tw-v组和HCC94组,差异有统计学意义,F=24.113,P=0.000;而两对照组之间差异无统计学意义,P=0.229。P-tw-1、P-tw-v和HCC94组平均穿膜细胞数分别为(263.67±18.04)、(126.00±17.69)和(116.33±9.87)个,p-tw-1组细胞数明显增多,差异有统计学意义,F=83.093,P=0.000;p-tw-v与HCC94组之间差异无统计学意义,P=0.478。P-tw-1、P-tw-v和HCC94组黏附细胞平均A值分别为0.38±0.01、0.53±0.01和0.57±0.01,p-tw-1组A值明显降低,差异有统计学意义,F=65.086,P=0.000;p-tw-v组与HCC94组之间差异无统计学意义,P=0.244。结论:Twist基因高表达可增强宫颈癌细胞增殖和迁移能力,降低其黏附能力;Twist真核表达载体和稳定高表达Twist的HCC94细胞系构建为进一步研究Twist功能奠定了基础。