从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制

目的：观察加味白头翁汤对结直肠癌MC38细胞荷瘤小鼠瘤体生长及肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润数量的影响，探析加味白头翁汤是否介导TAMs表型重塑以发挥抗肿瘤免疫调节效应。方法：首先构建鼠源MC38细胞株C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，设立模型组、阳性药奥沙利铂组（3 mg·kg-1）及加味白头翁汤高、低剂量组23.43、46.86 g·kg-1，每组各10只，另设立10只健康小鼠为空白组，观察各组小鼠体质量、瘤体体积及生存状态变化，摘取肿瘤组织、脾脏及外周血，计算瘤体体积变化、抑瘤率及脾脏质量；苏木素-伊红（HE）染色观察肿瘤组织病理形态学变化，免疫荧光实验检测荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4、CD8、CD206表达水平，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测荷瘤小鼠外周血清中细胞因子转化生长因子（TGF）-β、白细胞介素（IL）-6、趋化因子配体2(CCL2)的分泌水平；其次，使用MC38细胞株与鼠源单核巨噬细胞系RAW264.7细胞在体外构建IL-4诱导的共培养模型，细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测加味白头翁汤含药血清的细胞增殖抑制作用，Transwell实验检测IL-4诱导的M2型巨噬细胞对MC38细胞侵袭能力的影响，流式细胞术检测加味白头翁汤含药血清对IL-4诱导的M2型巨噬细胞干预后膜上CD86的表达变化，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测加味白头翁汤含药血清对共培养后M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-12及M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平的影响；最后，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测荷瘤小鼠肿瘤组织中集落刺激因子1受体（CSF1R）、干扰素基因刺激蛋白（STING）、TANK结合激酶1(TBK1)蛋白表达水平。结果：体内实验结果表明，与模型组比较，加味白头翁汤能明显抑制荷瘤小鼠瘤体的生长。免疫荧光实验结果表明加味白头翁汤能增加荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞浸润数量，降低CD206+TAMs浸润数量，且能下调荷瘤小鼠外周血清中细胞因子IL-6、TGF-β、CCL2的分泌水平；在体外实验结果中，加味白头翁汤含药血清无明显的细胞增殖抑制作用，但与RAW264.7细胞共孵育后的细胞上清液却能抑制MC38细胞的增殖活性，且IL-4诱导的M2型巨噬细胞能增强MC38细胞的侵袭能力，这一效应却能被加味白头翁汤含药血清呈浓度依赖性抑制。同时，Real-time PCR检测结果发现加味白头翁汤含药血清能上调M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、iNOS、IL-12 mRNA表达水平，下调M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平，流式细胞术结果也证实了加味白头翁汤含药血清能增加CD86+M1型巨噬细胞复极化数量，这表明加味白头翁汤能诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极化以发挥抗肿瘤生长作用。最后，Western blot检测结果表明加味白头翁汤能下调荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R蛋白表达，上调STING、TBK1蛋白表达。结论：加味白头翁汤能下调CD206+TAMs浸润数量，增加CD8+T细胞浸润，从而发挥对结直肠癌生长抑制的抗肿瘤免疫调节效应，这可能与其调节CSF1R信号，进而活化STING/TBK1信号通路，诱导TAMs表型重塑有关。