豇豆胰蛋白酶抑制剂cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达

从即将成熟的豇豆子叶中分离出总RNA,逆转录合成cDNA第一条链。参照已知的几种Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂基因序列,设计并合成了两段寡核苷酸引物,以单链cDNA为模板,进行PCR扩增,得到320bp的均一扩增产物,克隆到pBluescrip SK(+)的EcoRV位点上并转化大肠杆菌JM101。酶切图谱及DNA序列分析表明克隆到的片段含有编码完整80个aa的豇豆胰蛋白酶抑制剂结构基因和一段编码27aa的前导序列。利用限制酶NcoI对其前导序列进行缺失,只保留成熟蛋白结构基因上游第一个ATG密码子并克隆到大肠杆菌表达载体pKK233-2中进行表达研究,从转化细菌的提取物中检测到了外源CpTI基因表达产物对胰蛋白酶的抑制活力。