减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组附视频

采用９～１０日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２毒株，经差速离心法浓缩纯化后，提取病毒基因组ＤＮＡ。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白（ＴＰ）。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解纯化的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后，回收Ｃ、Ｄ、Ｅ片段。克隆到ｐＵＣ１９载体的ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ双酶切位点及ＨｉｎｄⅢ位点上，经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定，获得了ｐＵＨＣ、ｐＵＨＤ、ｐＵＨＥ重组质粒，其中ｐＵＨＣ含有末端片段。将ＥＤＳＶＳａｌⅠ水解产生并回收的大片段与ｐＵＨＣ在９５℃水浴中变性，６５℃复性后，用钙离子介导法，共转染５０％～７０％的单层鸭胚成纤维细胞，转染后３６ｈ开始产生细胞病变（ＣＰＥ）。４８ｈ后将病变细胞反复冻融，经尿囊腔接种９～１０日龄鸭胚，回收的尿囊液能凝集鸡红细胞，这种血凝性能被ＥＤＳＶ高免血清抑制，电镜下观察到腺病毒样颗粒。