Es wird eine Methode zur Pro teinbestimmung beschrieben, die auf dem Prinzip der quantitativen “Tüpfelprobe” beruht. Für eine Bestimmung werden 0.5-5 μl einer Protein-lösung mit einer Konzentration von 0.01 -10 mg/ ml benötigt. Die Probe wird in 0.5-, 1-, 2- oder 5-μl-Kapillaren durch Kapillarattraktion aufgenommen, auf eine Cellulose-Acetatfolie aufge-tragen und mit Amidoschwarz 10B oder einem fluoreszierenden Benzoxanthenderivat (Hoechst 2495) in Essigsäure/Methanol gefärbt und fixiert. Nach Auswaschen überschiissigen Farbstoffs (3 × 5 min) kann die quantitative Bestimmung auf verschiedenen Wegen (je nach vorhandenen Geräten) vorgenommen werden. 1) Die durch Inkubation in Dioxan/1-Butanol transparente, auf einem Objektträger fixierte Probe wird durch Densitometrie oder 2) durch In-situ-Fleckfluorometrie ausgewertet. 3) Kann die Probe mitsamt der Acetatfolie in Dioxan, Dimethylsulfoxid oder N,N-Dimethyl-formamid gelöst und entweder photometrisch oder 4) fluorometrisch ausgewertet werden.5) Die höchste Empfindlichkeit wird erreicht, wenn das an Protein gebundene Fluorochrom (Hoechst 2495) mit 15proz. NH4OH in Wasser eluiert und fluorometrisch gemessen wird. Zwischen der Fluoreszenz und einer Protein-menge von 10 ng bis 20μg besteht eine lineare Korrelation mit einem Korrelationskoeffizienten von 0.999. Diese Methode hat neben ihrer einfachen Hand-habung den Vorteil, daß andere Proteinbestim-mungen störende Reagenzien wie z.B. Dodecylsulfat, Mercaptoethanol, Triton etc. entweder keinen oder einen genau definierten Einfluß haben. Die Färbbarkeit der Proteine mit Amidoschwarz wird durch Dodecylsulfat (nicht durch Mercaptoethanol) in Abhängigkeit von der Dodecylsulfat-Konzentration stochiometrisch vermindert, die Färbung mit Hoechst 2495 bleibt hingegen völlig unbeeinflußt. Da bei konstanter Proteinkonzentration zwischen der Fläche eines Flecks auf der Acetatfolie und dem aufgetragenen Volumen im Bereich von 0.5-5 μl eine lineare Beziehung besteht und weil der Fleckdurchmesser bei festem Probenvolumen stöchiometrisch von der Proteinkonzentration beeinflußt wird, die durch die Amidoschwarz-Färbung erfaßt wird, kann anhand einer Schar von Eichkurven mit einem iterativen Verfahren auch dann die Proteinkonzentration in mg/ml bestimmt werden, wenn das eingesetzte Volumen im Bereich von 0.5-5 μl unbekannt war. © 1979 Walter de Gruyter & Co.
