大鼠单侧输尿管结扎模型和饥饿模型尿液蛋白质组研究

目的生物标志物指的是与生理或病理性过程相关的可监测的变化。在受到多种生理或病理性的因素刺激时,机体内原有的平衡状态被打破,相关器官、组织或细胞会产生异常的代谢产物。机体总是趋向于恢复原有的平衡,故而会将这些异常的代谢产物排出体外。尿液作为机体的一种排泄物很有可能承载和积累了这些来自于机体的多种变化,并可能是寻找生物标志物良好的生物学来源。在研究某种疾病特异性生物标志物时,为了排除尿液蛋白质组中其它生理或病理影响因素,应选择单一生理或病理因素变化所对应的尿液蛋白质组学的特异性变化进行研究,更有利于发现与该疾病直接相关的、有重要意义的尿液蛋白生物标志物。直接使用人的临床尿液样品来研究某种疾病所导致的尿液蛋白质特异性的变化存在着许多困难,尿液的诸多影响因素所引起的变化很可能掩盖或至少部分掩盖了疾病本身所引起的变化。直接使用这种方法来研究人类疾病尿液蛋白组学,往往需要大规模的样本量,极其耗时,而且难以获得可信的结果。因此选择动物模型这-更为简单、可控的研究系统进行研究,对于尿液蛋白组学的研究即寻找可信的尿液标志物来讲不失为一种更好的选择。进展性肾脏疾病多导致终末期肾损伤,而肾脏纤维化是其基本的病理学改变。临床上梗阻性肾病是肾脏纤维化的一大重要原因,以肾小管损伤和间质成纤维细胞的增殖为主要特征,因此寻找肾小管损伤和肾脏纤维化尿液生物标志物对于梗阻性肾病及其它慢性肾病的诊治具有重要意义。单侧输尿管结扎(UUO)模型被认为是梗阻性肾病经典的动物模型,其实验时间、造模严重程度可控性好。本研究采用UUO模型来研究梗阻性肾病不同病理状态下的尿液蛋白质组的变化,并验证了UUO模型大鼠肾小管损伤和肾间质纤维化两个病理过程所对应的尿液中几种显著变化的差异蛋白,为筛选和寻找梗阻性肾病潜在的尿液生物标志物提供了一定的线索。饥饿是生物体的一种正常生理现象,在此过程中,器官功能可发生不同程度的异常,而能量代谢亦会出现一系列的变化,引起体重下降、身体组成成分的变化以及代谢基因表达的改变。短期饥饿可能导致蛋白代谢的加速,引起尿液中氮排泄量增加、体内亮氨酸通量和氧化增加,这些均提示饥饿能够影响机体的蛋白质代谢,而这些变化很可能从尿液蛋白质组的变化中体现出来。蛋白质的翻译后修饰是指活细胞内的基因组经转录、翻译为蛋白质后,在蛋白质的一个或多个氨基酸残基上进行共价修饰的过程,在生命体中具有重要的意义。翻译后修饰的蛋白在细胞信号转导、酶活性调控等过程中发挥着重要的作用,并且翻译后修饰的类型和程度会因机体所处的不同环境、机体不同的生理和病理状态的影响而出现巨大的变化。因此,对于饥饿过程中尿液蛋白质组的研究不应只局限于对尿液蛋白质组成和含量变化的研究,还应关注这些尿液蛋白质的翻译后修饰类型、程度以及修饰位点的差异,这对于理解饥饿所导致机体的一系列变化有重要的意义。因此本实验主要研究了大鼠饥饿0、4、7d时尿液蛋白质组的变化以及蛋白质翻译后修饰的变化。方法1.实验分为假手术组和UUO模型组,其中UUO模型组采用分离大鼠左侧输尿管进行双结扎造模,假手术组只分离左侧输尿管不进行其它操作。造模成功后,尿液的采集是通过与肾脏相连的输尿管残端进行输尿管插管,共收取尿液3小时,其中前0.5小时尿液为肾脏在造模阶段储积的尿液,该部分尿液不进行分析；后2.5小时尿液为损伤肾脏新产生的尿液并用于后续蛋白组学研究。这种方法采集的尿液与梗阻性肾病患者的尿液有一定的相似性。尿液采集完成后,腹主动脉采血,并收取造模侧肾脏用于后续研究。提取尿蛋白进行膜上酶切,用质谱定量的方法研究模型不同病理变化所对应的尿液蛋白质组学的变化,筛选有意义的差异蛋白,在各组尿液、肾组织内进行western blot和免疫组织化学验证。2.实验研究了大鼠饥饿不同时间后尿液蛋白质组的变化,分别在大鼠饥饿0、4、7d时测量大鼠体重,观察体重的变化,并收取大鼠的尿液和血液进行生化检测,观察生化指标的异常情况；质谱检测饥饿不同时间点大鼠尿液蛋白质组的变化,包括蛋白组成相对量的变化以及翻译后修饰的变化。结果1.HE和Masson染色证明造模成功后,采用质谱定量方法研究了肾小管损伤所对应的UUO模型较早阶段(UUO模型1w)和肾间质纤维化所对应的UUO模型较晚阶段(UUO模型3w)大鼠尿液蛋白质组的变化。共鉴定到尿蛋白500个,其中与对照组1w组相比,UUO模型1w组显著变化的蛋白共7个,与对照3w组比较,UUO模型3w组显著变化的蛋白共18个。选择5个在UUO模型中出现显著变化的尿蛋白,在尿液和肾组织中进行验证。尿液蛋白western blot验证以及肾组织western blot和免疫组织化学验证显示,Alpha-actinin-1和Moesin蛋白水平在UUO模型1w组即可出现升高,而Vimentin, Annexin A1和Clusterin蛋白水平在UUO模型3w组有所升高。2.随饥饿时间延长,大鼠体重以及每日排尿量均降低,且差异具有统计学意义。尿液、血浆生化检测发现尿肌酐水平显著升高、血浆总蛋白水平显著降低,差异具有统计学意义。采用质谱定量方法研究了饥饿不同时间点0、4、7d时大鼠尿液蛋白质组的变化。共鉴定到尿蛋白664个,其中与饥饿0天相比,饥饿4天显著变化的蛋白共5个,饥饿7d显著变化的蛋白共13个,其中有3个蛋白重合；同时,饥饿后尿蛋白的翻译后修饰也会发生一系列的变化。结论1.在UUO模型1w组出现显著变化的尿蛋白可能作为肾小管损伤这一病理过程潜在的尿液生物标志物,在UUO模型3w组出现显著变化的尿蛋白可能作为肾间质纤维化这一病理过程潜在的尿液生物标志物。2.饥饿可能通过影响机体的代谢而引起尿液蛋白质组在量和翻译后修饰上的一系列变化。饥饿所对应的发生特异性改变的尿蛋白可作为疾病生物标志物研究中应被排除的干扰蛋白,更有利于发现特异性的疾病尿液生物标志物。翻译后修饰的变化主要是甲酰化和磷酸化的蛋白数量减少,对于探讨尿液中蛋白质存在的意义提供一定线索。