慢性乙肝治疗性复制子DNA疫苗pSVK-HBVA细胞免疫活性研究和细胞模型的初步建立

研究背景： 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）慢性感染多年来已成为影响公共健康的世界性难题之一，每年大约有100万人死于HBV慢性感染所致的肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。迄今为止，HBV慢性感染尚无有效治疗手段，通过治疗性疫苗激发机体自身免疫是治疗慢性乙肝的重要途径。课题组在治疗性疫苗领域多年研究探索，自主研发的新型复制子DNA疫苗载体系统pSVK，能在常规DNA疫苗1/100的剂量即可激发高效的细胞免疫应答。针对慢性乙肝治疗中的核心难题“免疫耐受”，实验室前期构建了融合多种免疫增效策略的新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA，使其在靶抗原摄入、表达、呈递和免疫应答激活等多个方面具备突出优势，有利于打破慢性乙肝的免疫耐受。本研究拟开展乙肝新型治疗性疫苗pSVK-HBVA免疫小鼠后的细胞免疫应答研究，同时为检测新型疫苗pSVK-HBVA的细胞毒T淋巴细胞（cytotoxicity Tlymphocyte,CTL）活性，还构建了融合HBV多种抗原基因的重组表达质粒pIRES-neo-HBAg。 研究目的： 开展新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA免疫小鼠后的细胞免疫应答研究，进一步验证经过疫苗优化设计后的新型治疗性复制子DNA疫苗的免疫治疗功效。此外，还构建了包含HBV多个抗原区段的真核表达质粒pIRES-neo-HBAg，初步筛选了混合克隆细胞株，为进一步筛选稳定表达HBV融合抗原的单克隆细胞株奠定实验基础。 研究方法： 首先，以本研究室前期构建的HBV新型治疗性复制子DNA疫苗pSVK-HBVA免疫BALB/c小鼠，末次免疫后一周进行分离小鼠脾脏淋巴细胞，通过IFN-γ释放的酶联免疫斑点（ELISPOT）法检测免疫后小鼠的CD8+T细胞活性，CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测淋巴细胞在特异性乙肝抗原刺激下的免疫增殖活性，ELISA法检测脾淋巴细胞免疫相关细胞因子包括Th1类因子IL-2、IFN-γ和Th2类因子IL-4、IL-10的免疫释放；其次，为进一步研究该疫苗激活的CTL免疫反应，以pVAX1-HBVA为模板，设计引物进行PCR扩增包含HBV前S1、前S2、HBsAg和HBcAg的融合抗原基因（命名为HBAg），克隆入真核表达载体pIRES-neo中，构建重组表达质粒pIRES-neo-HBAg，并进行酶切和测序验证；最后将重组质粒pIRES-neo-HBAg进行脂质体法瞬时转染293T细胞，转染后48h通过Western blot、流式细胞术及免疫荧光等方法检测和分析其表达情况，然后,再将提取的pIRES-neo-HBAg重组质粒转染Hepa1-6细胞（BALB/c小鼠来源的肝癌细胞），确定G418的最佳筛选浓度，加压筛选后获得阳性混合克隆，流式细胞术检测HBV融合抗原的表达。 研究结果： HBV新型治疗性复制子DNA疫苗pSVK-HBVA，在免疫剂量仅为1μg时就表现出很强的细胞免疫学活性。在特异性抗原刺激下疫苗免疫组小鼠淋巴细胞IFN-γ因子释放显著，CD8+T细胞被免疫激活；CCK-8检测显示疫苗免疫组小鼠的脾淋巴细胞显示出很强的增殖活性；细胞因子释放的ELISA检测显示，疫苗免疫后激活的细胞免疫反应向Th1类反应偏移。此外，重组质粒pIRES-neo-HBAg经酶切鉴定和测序分析，证实构建成功；瞬时转染293T细胞后，经Western blot检测显示， HBV融合基因得到表达，且分子量大小正确；流式细胞术检测显示，表达融合抗原HBAg的阳性细胞率为20.43%；免疫荧光检测结果显示重组质粒pIRES-neo-HBAg转染细胞显示红色荧光，获得有效表达。随后，将重组质粒pIRES-neo-HBAg转染Hepa1-6细胞，并用800μg/ml的G418加压筛选，初步筛选获得了稳定表达HBV融合抗原的混合克隆细胞，流式细胞术检测显示HBV融合抗原基因的阳性细胞率可达86.20%。 研究结论： 新型治疗性复制子DNA疫苗pSVK-HBVA在免疫剂量较低的情况下即可激活高效的细胞免疫应答，且激活的免疫反应向Th1类应答偏移，有利于改善常规DNA免疫原性不足的问题，也有利于克服慢性乙肝的免疫耐受。此外，本研究还构建了表达乙肝多种复合抗原的真核表达质粒pIRES-neo-HBAg，初步筛选了混合克隆细胞株，为建立有效的HBV体外细胞模型和方便的荷瘤小鼠动物模型奠定了基础。