川芎苓种标准化及种质保存技术的研究

川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的根茎,为我国的传统中药,也是著名的川产道地药材,具有近两千年的栽培和使用历史,长期以来生产上均以无性方式进行繁殖,其繁殖材料为膨大的地上茎节(苓种)。经过上千年的栽种,加上缺乏选种育种,存在一定程度的种质退化。四川主产区药农对苓种繁育仍然停留在自繁自用,缺乏统一的生产技术规程和科学的组织管理,且没有苓种分级标准和检验规程,导致川芎苓种质量良莠不齐。另外,目前生产上仍然采用传统的自然存放方法贮存苓种,不能久贮；种质保存只能采用传统的田间保存方法,存在耗费人力物力,容易损失等诸多缺点,而相关研究尚属空白。 中药材质量稳定需要中药材生产的规范化,中药材生产规范化需要中药材种子种苗的标准化。优良品种和优质的种子种苗是实现中药材规范化生产的基础和源头。本文针对川芎规范化生产中的薄弱环节,以苓种标准化问题为切入点,开展了川芎苓种的标准化研究和种质保存技术研究,以推动川芎苓种的标准化进程,为川芎规范化生产提供源头保障。以生产出优质、高产、稳定、可控的川芎药材,促进川芎产业的可持续发展。研究结果如下： 1.川芎苓种的调查、收集 在前期全国川芎种质资源调查的基础上,本文重点对四川省内川芎主要产区及苓种繁育地所涉及的5个市县20余个乡镇进行了实地调研,基本弄清了四川川芎苓种的分布和主产区的演迁、当地传统繁育技术、苓种保存方法、质量评判及产销情况等；调查表明,近年来,尤其是5.12汶川大地震后,发生了一些变迁,目前主要集中在都江堰市中兴镇、都江堰市青城后山红岩、都江堰市虹口乡,彭州市小渔洞镇、龙门山镇、通济镇,汶川县水磨镇、三江口镇,崇州市三郎镇,什邡市冰川镇等,海拔在900m-1500m。其中彭州小鱼洞镇的川芎苓种繁育面积较大。 主产区苓种的来源主要是坝区药农定点委托山区药农代为自繁自用,收获的苓种多数供坝区自我栽种,少数流入集市销售供其他栽种所需。川芎苓种市场上质量良莠不齐,无统一标准规范。另外,近年在一些川芎主产区和苓种集市上出现了少量“坝苓种”、“冻苓种”和“山区自栽苓种”,已在四川省内或调往省外作为川芎生产用种。 调查同时,收集了不同产地、不同集市的川芎苓种共34分,部分保留在前期建立的川芎种质资源圃中,部分提供给国家药用植物种质资源库,部分作为课题研究用。 2.川芎苓种贮藏及种质保存技术研究 针对川芎生产用苓种,首次进行了常温保存及低温贮藏技术研究,弄清了苓种在常温条件下存放6～10天,脱去的水分适中,不会影响发芽率,为川芎苓种采收后的短期贮藏提供了科学依据；建立了川芎苓种冷藏保存方法,可使川芎苓种短期保存时间延长至3个月,为该方法的进一步的推广应用,以满足川芎不同栽种地区对川芎苓种不同贮藏时间的需求及改变川芎苓种自繁自用,促使其商品化奠定了基础。 针对川芎种质中长期保存,首次采用限制生长保存法,以川芎茎段为组培材料,以MS为固体培养基,建立了川芎试管苗培养方法,对比了改变培养环境、调整培养基养分水平、添加渗透性化合物和生长抑制剂等实验,得到了川芎种质限制生长保存最佳方案。恢复生长实验表明保存6月后的种质能生长成活,保存苗和对照苗的形态特征与同工酶检测分析,没有发现变异现象,保持了良好的遗传稳定性,为实现川芎种质材料的中长期保存奠定了基础。 同时采用玻璃化法对川芎种质超低温保存的可行性进行探索,找到了适合的川芎玻璃化法的外植体是川芎茎尖,建立了川芎组培再生苗的培养方法,为进一步深入研究打下了基础。 3.川芎新品种选育研究 在前期川芎种质资源鉴定的基础上,构建成了由1300个株系,约8000个单株组成的育种用群体。利用该群体,采用系统选育的方法进行了川芎优良新品种选育,从优良单株选择、优良株系的筛选、品系比较试验、品种(系)多点试验,最终选育出川芎优良新品种“绿芎1号”,并通过四川省农作物品种审定委员会的药用植物新品种审定。该品种具有成株叶色浓绿,持绿期长,生长旺盛,群体整齐性、一致性较好,抗病性强的特点,并表现出良好的丰产性、稳定性和适应性,其药材质量符合《中国药典》的相关规定。为逐步实现川芎品种的标准化奠定了基础,为川芎药材的规范化生产提供了优良种源。 4.川芎苓种繁育技术研究 在前期研究的基础上,深入进行了川芎苓种的繁育技术规程的研究,包括适宜栽种区域、产地环境条件、选地与整地、抚芎的选择与处理、栽种、田间管理、病虫害防治、采收与采后处理等,确定了川芎苓种繁育各环节最适宜的方法和措施。在此基础上制订了川芎苓种繁育技术操作规程(SOP),为山区苓种繁育地优质苓种的生产提供了技术保障。 5.川芎苓种质量标准研究 首次进行了川芎苓种质量检验规程的研究,针对川芎繁殖材料的特殊性,结合产区药农传统经验,创新性的提出了以外观形态、百粒重、苓子系数、混杂率、病虫害等作为川芎苓种质量评价的综合指标,并制定了川芎苓种质量检验规程,内容包括真实性鉴定、形态指标、重量测定方法、苓子系数、混杂率、病虫害。为川芎苓种的质量评判提供了技术支撑。 首次进行了川芎苓种分级标准的研究,通过对比不同等级川芎苓种对其植株生长发育、药材产量和质量的影响,结果表明,不同等级苓种对川芎的生长有显著性的影响,并且在川芎的不同生长时期其影响因素有差异,一、二等苓种的川芎在植株生长发育及药材产量上均明显优于三等苓种的川芎；药材质量方面,不同等级苓种的川芎在药材性状、薄层色谱、主成分含量上无明显差异。在总结药农长期实践经验和前期研究的基础上,根据不同等级苓种对植株生长发育和药材产量、质量影响的实验研究结果,并结合生产实际,拟订了川芎苓种等级划分标准。 在上述研究基础上,起草了《川芎苓种质量标准(草案)》。为川芎苓种生产、流通、检验和使用提供了标准依据。