益母草生物碱调控的营养条件及其作用机理研究

药用植物栽培是实现药用植物资源可持续利用的有效途径,目前人工栽培中存在的药材质量不稳定等问题是影响中药质量的重要方面,所以如何通过规范化栽培措施来促进药材质量的提高,是中药材生产中急需解决的问题。施肥是栽培措施的核心,对药用植物施肥的研究非常有必要。本论文以常用大宗药用植物——益母草(Leonurus japonicus Houtt.)为研究材料,对其野生药材质量和主要土壤环境特征进行了研究,并设计室外大田氮磷钾肥效试验、盆栽氮磷钾肥效试验、盆栽不同微量元素喷肥试验和室内不同氮素、锰素和pH值营养液水培试验,做了不同的营养元素和pH值处理对益母草生物碱的生物合成和积累的调控研究。主要研究结果如下: 1.野生益母草质量及其与土壤环境关系的研究表明:不同产地益母草水苏碱含量差异显著(P<0.05),益母草不同部位的水苏碱含量之间差异达到极显著水平(P<0.01),其高低顺序为:繁殖部位>叶>茎。土壤pH值与叶片水苏碱含量的相关性达到显著水平(r=0.58),说明碱性土壤有利于水苏碱的积累。 2.通过室外大田和盆栽益母草的氮、磷、钾土壤施肥试验,得出不同氮磷钾施用量和配比组合对益母草的各项生长指标株高、地径、叶面积、产量和生理指标叶绿素、类胡萝卜素、可溶性蛋白含量、光合作用以及水苏碱和总生物碱含量的影响达到极显著水平(P<0.01),影响顺序基本都为氮>钾≈磷。不同浓度的微肥对益母草的水苏碱含量都有不同程度的促进作用,其中低浓度的锰、锌和铁对其促进作用达到显著水平(P<0.05)。不同微量元素对水苏碱的影响顺序为:锰>锌>铁>钼>对照。 3.通过室内营养液水培试验,在不同的氮素梯度试验中,高氮处理极显著提高了益母草水苏碱和总生物碱的含量(P<0.01),叶面喷锰比缺锰对生物碱的促进作用也达到极显著水平(P<0.01),碱性营养液也显著促进了益母草生物碱的含量(P<0.05)。氮元素和锰元素是通过促进其各项生长、生理和激活其生物合成过程来最终导致益母草体内生物碱的含量提高。而pH值则仅通过激活其生物合成过程来提高其终产物生物碱的含量。 4.通过对益母草水苏碱生物合成途径进行推理假设,并对合成途径中关键中间产物进行监测和分析,证明该假设成立。同时发现氮、锰和pH值对生物碱合成的影响机制存在一定的差异,缺氮的关键调控点发生在α-酮戊二酸到谷氨酸的还原氨化反应步骤中,高氮的关键调控点发生在鸟氨酸到水苏碱的希夫碱Schiff形成反应步骤中,而pH值则发生在α-酮戊二酸到谷氨酸的还原氨化反应步骤中,锰元素对其促进作用在各个步骤都有表现。从3种不同的调控措施来看,在培养60天时,能使水培益母草生物碱百分含量达到0.8%的关键中间产物在功能叶片中的含量为:丙酮酸35μg/g,α-酮戊二酸75μg/g,谷氨酸0.229mg/100mg、鸟氨酸0.006mg/100mg、总氨基酸1.419mg/100mg干燥粉末。此时益母草叶片的茉莉酸的含量为1163ng/g。 5.通过激素分析发现,茉莉酸含量与益母草水苏碱含量呈显著相关(r=0.93),确定茉莉酸是益母草水苏碱生物合成的信号转导物质。在分析的20种氨基酸中,与益母草生物碱含量呈显著正相关的氨基酸有:谷氨酸、鸟氨酸、半胱磺酸、天门冬氨酸、丝氨酸、γ-氨基丁酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸,其相关系数r平均为0.96。 6.本论文经过精细水培试验得出益母草的最佳需氮量为5mmol/L,在碱性营养液中和底肥为0.6×10-3mmol/L的营养液浓度下,再喷以0.6×10-3mmol/L的MnSO4溶液3次,会显著提高益母草的生物碱含量。经过大田试验和盆栽试验得出相同的结果,即沙土栽培益母草的最佳氮磷钾施肥量为:氮40g/m2,磷44.8 g/m2,钾33.3 g/m2。在此基础上,给益母草喷施含少量Mn、Zn和Fe的微量元素溶液,会进一步促使其生物碱含量的提高。 本论文的特色和创新之处可以归纳为以下几个方面: 1.采用大田、盆栽和水培试验方法对益母草生物碱的营养条件影响机理从生长、生理、生物碱的生物合成途径和终产物等方面进行动态监测和系统研究,揭示了益母草生物碱的调控机理。 2.通过试验,提出保护环境和节约成本的施肥措施:在施用少量合理配比大量元素肥料的基础上,通过喷施适宜的微量溶液来提高有效成分的含量。 3.对益母草水苏碱生物合成途径进行推理假设,并经试验证明此途径合理存在。找到水苏碱合成过程中的关键限速步骤,即发生在α-酮戊二酸到谷氨酸的还原氨化反应步骤和鸟氨酸到水苏碱的希夫碱Schiff形成反应步骤。 4.发现茉莉酸是益母草水苏碱生物合成的信号物质。初步确定与益母草生物碱呈显著正相关的9种氨基酸。 5.改进了益母草水苏碱的高效液相测量方法。改进了植物体内有机酸含量的高效液相测量方法。