湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病活性与物质基础研究

湖北麦冬(Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma)是湖北省的道地药材,是中药麦冬的主流品种之一。在中医临床上湖北麦冬与杭麦冬和川麦冬等同入药,用于治疗热病伤津、心烦口渴等症。在古今治疗糖尿病(消渴病)的中药复方中麦冬常作为主药,近年多位学者就麦冬的“消渴”作用做了一些抗糖尿病研究,表明川、杭麦冬具有抗糖尿病的作用,并初步证明其发挥抗糖尿病作用的活性物质主要是麦冬多糖。对湖北麦冬多糖降血糖的相关研究在国内外还未见公开报道,但湖北麦冬多糖极可能也具有降血糖活性。鉴于此,在国家自然科学基金和国家十一五科技支撑计划的资助下,本论文对湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病活性、活性物质(湖北麦冬多糖)的制备工艺、理化性质及结构特征进行了研究。 本论文由四个部分组成。第一部分为湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病的活性及作用机理研究,证实湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病活性,确定其活性物质基础为多糖成分,并推测改善胰岛素抵抗是其抗Ⅱ型糖尿病机理之一。第二部分为湖北麦冬多糖(TLSP)制备工艺研究,确定出一条稳定、天然、高效的湖北麦冬多糖实验室制备路线。第三部分是湖北麦冬多糖(TLSP)的理化性质及结构研究,获得了TLSP及从中分离出的均一多糖(LSP1和LSP2)稳定的理化参数,并解析出LSP1和LSP2的一级结构特征。第四部分是综述,对2005年1月至2010年12月报道的具有潜在抗糖尿病活性的单体化合物进行了概括。 第一部分 为探究湖北麦冬是否具有抗糖尿病(Ⅱ型糖尿病)活性、活性物质是什么,本研究首先采用高脂高糖饲料+小剂量STZ诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠模型,对湖北麦冬抗糖尿病活性成分提取溶剂(95%乙醇或水)进行筛选研究,确定只有水提取物(WE)具有较强的抗糖尿病活性(降低糖尿病小鼠的空腹血糖(P<0.01),改善糖尿病小鼠糖耐量(P<0.01))。 接着,本研究对湖北麦冬水提取物(WE)进行分离、纯化,得到湖北麦冬粗多糖(CP)、总多糖(TLSP)及无糖部位(NP),并采用同样的动物模型对各部位进行活性筛选,确定WE、CP、TLSP均具有较强的抗糖尿病活性(降血糖及改善糖耐量,P<0.01),活性强度依次为WE0.05)。而且能降低血总胆固醇(P<0.01)和甘油三酯(P<0.01)、增加高密度脂蛋白相对含量(P<0.01)并降低低密度脂蛋白水平(P<0.01),其效果均较罗格列酮好(P<0.05或P<0.01),体现湖北麦冬多糖能从多方面综合治疗糖尿病、缓解其症状。通过各方面综合比较,确定三者抗Ⅱ型糖尿病活性强度基本相当：TLSP≈LSP1≈LSP2,100mg/kg≈200mg/kg。由于TLSP的制备工艺相对简单,工业生产周期短、成本低。因此本项目组选择TLSP为候选药物进行后续开发,并初步确定其对小鼠的有效剂量为100mg/kg。 同时,在对TLSP、LSP1和LSP2的药效学研究中,发现TLSP、LSP1和LSP2均具有改善胰岛素抵抗(HOMA-IR)的作用,因此,本课题顺着胰岛素抵抗这条路线,研究湖北麦冬多糖对改善胰岛素信号转导通路和肝糖代谢的影响,以初步探究抗Ⅱ型糖尿病机理。机理研究结果表明,TLSP、LSP1和LSP2均能明显提高糖尿病小鼠肾脏组织中胰岛素信号因子—胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的表达水平(P<0.01),进而改善胰岛素信号传导,增加组织对胰岛素的敏感性,从而改善糖尿病症状,这是湖北麦冬多糖抗糖尿病机理之一。同时,TLSP、LSP1和LSP2还能增加肝糖原含量(P<0.01)及葡萄糖激酶(GcK)活性(P<0.01),降低葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)活性(P<0.01),从而改善糖尿病小鼠肝内糖代谢紊乱,增强肝细胞合成糖原及促进葡萄糖利用,进而改善糖尿病症状,这是湖北麦冬多糖抗糖尿病机理之二。 第二部分 在确定以湖北麦冬多糖TLSP作为抗糖尿病候选药物开发后,本研究分别采用正交和单因素实验对TLSP的沸水提取、酶解除蛋白质、透析除小分子、醇沉及DEAE-纤维素柱层析脱色工艺进行优化。经反复验证,得到一条稳定的TLSP制备路线。确定出的制备路线为： 取湖北麦冬干燥块根的粗粉,煎煮3次,每次加入水的体积分别为粗粉重量的4、4和2倍,每次30分钟,合并滤液,60℃减压浓缩得到6倍药材体积粗多糖液；将粗多糖液调节pH 6和水浴温度45℃,加入0.3%药材量的木瓜蛋白酶(12U/mg),酶解2小时,将酶解后的多糖液煮沸5 min,静置放冷,抽滤去沉淀。然后将滤液装入透析袋(Mw1000)(装入的液体量不超过透析袋容积的2/3)用自来水和蒸馏水各透析1天,去除小分子。透析后的袋内多糖液(保留部分)缩到原药材重量的1.5倍体积,加入95%的乙醇,以乙醇终浓度80%在室温下(20±2℃)醇沉24h,收集沉淀；上清液减压浓缩到原药材重量的1.0倍体积,再加入95%的乙醇,以乙醇终浓度80%在室温下(20±2℃)再醇沉24h,收集沉淀；合并沉淀部分,真空／冷冻干燥获得湖北麦冬粗多糖。湖北麦冬粗多糖蒸馏水溶解、调节浓度0.2g/mL,采用DEAE-纤维素52层析柱脱色纯化,上样体积5mL/g填料,上样及洗脱流速2.5柱体积/h(BV/h),蒸馏水／纯水为洗脱剂,水洗量3 BV,收集量6 BV(从上样后第2 BV的下柱液开始收集)。收集到的多糖液减压浓缩、真空／冷冻干燥即得湖北麦冬多糖TLSP。 第三部分 为了更好的对湖北麦冬多糖(TLSP)进行质量控制,本论文对TLSP的理化性质及其主要的组成成分(LSP1和LSP2)的一级结构特征进行研究。 主要结果如下： (1)从TLSP中分离得到2个结构新颖的均一多糖,LSP1和LSP2,两均一多糖分别占TLSP的25.4%和64.2%。 (2)运用多种物理、化学方法对TLSP、LSP1和LSP2的常规理化性质进行了研究,获得了TLSP、LSP1和LSP2稳定的理化参数。 (3)运用多种光谱、色谱、化学等方法对LSP1和LSP2的一级结构进行研究,获得LSP1和LSP2较精确的结构信息。LSP1为小分子果聚糖(Mw为3199),聚合度为20,由19个β-D-果糖和1个α-D-葡萄糖构成；其主链是以1、2链接的果糖残基构成,有6个重复单元,每个单元包含1个1、2位连接的双取代果糖残基、1个1、2、6位连接的三取代果糖残基和1个2位连接的单取代果糖残基；多糖主链的一个末端以2位羟基与1个α-D-葡萄糖的1位羟基链接成苷,另一个末端以1位羟基与1个β-D-果糖的2位羟基链接成苷。LSP2也为小分子果聚糖(Mw为4287),聚合度为26,由25个β-D-果糖和1个α-D-葡萄糖构成；其主链是以1、2链接的果糖残基构成,有6个重复单元,每个单元包含2个1、2位连接的双取代果糖残基、1个1、2、6位连接的三取代果糖残基和1个2位连接的单取代果糖残基；多糖主链的一个末端以2位羟基与1个α-D-葡萄糖的1位羟基链接成苷,另一个末端以1位羟基与1个β-D-果糖的2位羟基链接成苷。 第四部分 本部分对2005年1月至2010年12月报道的具有抗糖尿病潜力的单体化合物进行了概括,侧重于介绍从药用植物分离获得的一些具有抗糖尿病活性的化合物(包括已知的和新发现的),包括皂甙、黄酮、生物碱、蒽醌类、萜类、香豆素类、酚类、多糖和其他一些化合物,以说明抗糖尿病天然产物研究的必要性。