甘草与芫花合用对肠粘膜P-糖蛋白及药物经肠粘膜转运的影响

背景和目的 P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是属于ABC（ATP—binding cassette）转运体超家族的能量依赖性膜蛋白,分子量为170 kDa,可发挥外排泵作用,将细胞内的化合物逆浓度梯度转运至胞外,从而降低细胞内的药物浓度。P-gp除在肿瘤细胞中高度表达外,在正常机体组织和器官如肝脏、肾脏、胎盘、大脑、睾丸及肠刷状缘膜等部位均有高水平的表达。存在于肠上皮细胞刷状缘膜中的P-gp能将药物从浆膜侧泵回至粘膜侧而进入肠腔排出,导致药物透膜吸收减少,血药浓度降低。因此,受肠粘膜P-gp调控的经肠道吸收药物可以通过抑制肠粘膜P-gp的活性而增加吸收,提高生物利用度。现已证实,许多药物均为肠粘膜P-gp的抑制剂,例如维拉帕米、环胞菌素A、奎尼丁、一些表面活性剂等。 中药十八反是中医界沿袭数千年的用药禁忌。有研究表明,甘草与反药合用前后对细胞色素P450具有不同的调控作用。令人感兴趣的是P-gp的底物特异性很大程度上与细胞色素P450同工酶(CYP3A1-3)相似,二者有很多重叠的底物,如利福平、利多卡因、地高辛以及环孢菌素等。那么,这些反药对合用前后也有可能对肠粘膜P-gp产生不同的调节作用,这可能是反药合用引起临床上产生毒性的原因。文献检索表明,目前国内外尚未见由探讨肠粘膜P-gp的表达同中药配伍合理性之间的研究报告,因此探讨中药反药对合用后毒性增加是否同P-gp表达的改变等研究具有较高的学术价值。 本课题选择十八反药对中的甘草与芫花作为模型药对进行研究。利用体外扩散池法（Ussing chamber）和在体In situ实验,分析甘草芫花合用前后对肠粘膜P-gp表达的影响。选择P-gp典型底物药物罗丹明123（R123）和旁细胞途径药物荧光素钠（CF）作为试验药物,因为这两种化合物容易分析,都具有可见光范围的荧光,检测灵敏度高,作为其转运方式的标志物已广泛应用于各种研究。期望能间接地说明甘草芫花合用前后对P-gp调控的规律性,阐明两者合用引起毒性增加的可能作用机制。 内容和结果 中药根据不同产地、不同炮制方法,质量存在很大差别,因此要首先对实验中所用的中药甘草与芫花进行鉴别,并制备一定浓度的甘草液、芫花液、甘草芫花合煎液和甘草芫花合并液,用HPLC法建立图谱,保证实验过程中药材质量的一致性。流动相甲醇:水=1:9,检测波长:254 nm,流速:1 mL·min-1,进样量为20μL。HPLC实验结果发现甘草芫花合煎液与合并液图谱存在差异,这种差异是否会造成不同煎煮工艺对肠粘膜P-gp的调控的不同,有待于后续实验研究。 使用体外Ussing chamber实验评价R123、CF经空肠粘膜的经时吸收方向和分泌方向的累计透过率和表观渗透系数（Papp）,测定不同浓度维拉帕米（P-gp经典抑制剂）对R123和CF经空肠粘膜透过性的影响。结果R123在空肠中的转运渗透系数分泌方向大于吸收方向（约为四倍）,表明其在小肠中的转运是以分泌为主,说明泵出系统的存在。细胞旁途径转运的CF不受肠粘膜P-gp的介导,分泌方向和吸收方向的Papp近似相等（ER=1.08）;试验浓度的维拉帕米能够显著提高R123的吸收,并且能够明显抑制其分泌方向上的转运,而对CF在肠粘膜的转运则无影响。这些结果与国外文献报道一致,说明在我们实验室条件下进行Ussing chamber实验是可行的。 将大鼠灌胃不同浓度各种中药液,1周后用体外Ussing chamber法评价各种药液对R123和CF经空肠粘膜透过性的影响。实验发现低浓度的甘草液可以增加R123经空肠粘膜的吸收,对其分泌的影响则无统计学意义（P＞0.05）;芫花液、合煎液以及合并液均可以减少R123分泌方向的透过,增加其吸收方向的透过。甘草对CF经空肠粘膜透过无影响,而其他3组药液则可显著减少CF吸收和分泌方向的透过性。 建立测定R123血药浓度的高效液相-荧光检测法。流动相为乙腈-1%三乙胺（28:72）,流速为1.0 mL·min-1;荧光检测器波长为485 nm（激发波长）,546 nm（发射波长）。R123检测浓度在15.625～500 ng·mL-1范围内线性关系良好,标准曲线为S=5420.2C+341494（R2=0.9997）,最低检测限为5 ng·mL-1,血浆样品的提取回收率和方法回收率理想,日内与日间RSD均小于4%,样品提取后24h内及5次冻融稳定性良好。 大鼠灌胃各种药液后,利用在体In situ实验测定R123和CF在血浆中药物浓度的变化,计算各种药动学参数。实验发现甘草组R123最高血浆浓度Cmax、曲线下面积AUC0-240min和生物利用度F与对照组比较无统计学差异,而芫花组、合煎组和合并组Cmax、AUC0-240min和F均大于对照组（P＜0.01）,并且合煎组与合并组AUC0-240和F与芫花组相比,增加了将近一半,差异有统计学意义（P＜0.01）,而合煎组与合并组比较则无统计学意义（P＞0.05）;大鼠灌胃芫花后,CF的各药动学参数与对照组比较无统计学差异。 结论和讨论 结合体内外实验结果,可以推断芫花可以显著抑制P-gp的表达。那么在临床上,芫花有可能配伍一些易产生耐药性的抗肿瘤药物,或者制成肿瘤药物耐药性逆转剂,以增加抗癌疗效;也可以尝试在药物的制备中,适当加入芫花,改善一些P-gp底物药物的吸收。而芫花对CF的作用可能是芫花一方面抑制其吸收,另一方面抑制分泌,吸收和分泌量都减少,从而导致其最终生物利用度与对照组无差异,这结果与芫花是P-gp的抑制剂并不矛盾。 中医素有“十方九草,无草不成方”之说,甘草配伍其他药物可以起到增强药物疗效的作用。实验表明甘草对P-gp有轻微抑制趋势,甘草可能是通过直接或间接对P-gp的调控作用,改变了胃肠粘膜通透性,从而引起不同药物吸收的增加。这为将来对甘草“调和诸药、增强疗效”的作用机制研究,提供了一个很好的方向,可以试图从甘草对肠粘膜中各种转运蛋白的影响方面进行研究,科学地认识甘草对不同转运方式的药物经胃肠道粘膜渗透和吸收影响的可能机制,从而为临床广泛应用甘草配伍其他药物提高疗效提供更多的依据。 甘草芫花合用后与单用芫花相比,对P-gp抑制作用增强,但是合煎与合并两种炮制方法对P-gp的影响无差异。说明合煎液与合并液色谱图的不同对两者对肠粘膜P-gp的调控无影响。我们可以推断甘草与芫花配伍有毒,可能是甘草对芫花有协同作用,使芫花中某些抑制P-gp表达的化学成分作用加强,从而使芫花中有毒成分的分泌减少,吸收增加而导致其产生毒性作用;从另一方面考虑,芫花与甘草合用产生毒性,也有可能是芫花使甘草中一些有毒的物质（P-gp底物）吸收增加,这还有待于未来的进一步实验。 在课题研究中由于时间、精力等原因,也存在很多不足。例如,在实验中只分析了甘草芫花合用对空肠粘膜P-gp的影响,没有对其他肠段进行研究;大鼠灌胃时间只选择7 d,而没有做不同灌胃时间的动物实验;实验只做了定性分析而未做定量分析等。这些缺憾希望能在将来的研究中加以弥补。