动脉粥样硬化大血管和微血管病变的干预靶点研究

1研究背景 动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)不仅可以累及体循环的大中动脉也可累及前小动脉和小动脉导致微血管病变,这些血管病变可引起多个器官的形态和功能异常,其中,心、脑、肾是主要的AS靶器官,可导致心肌梗死、缺血性心肌病,脑卒中和慢性肾病,最终导致多器官功能衰竭和死亡。因此,深入研究AS大血管和微血管病变的发生机制和干预靶点,对于AS的防治具有重要的理论和实际意义。 九十年代以来大量研究显示,AS易损斑块的形成是急性心脑血管事件的主要原因,因此,斑块易损性也成为国内外研究的热点,其主要的病理学特点包括较薄的纤维帽,较大的脂质核心和大量炎性细胞浸润。由于胶原是纤维帽的主要构成成分,因此斑块内胶原代谢紊乱是影响斑块易损性的重要因素。 4-羟基-脯氨酸羟化酶(P4H)是所有已知类型的胶原合成过程中的关键酶,能够催化位于X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)重复序列中的脯氨酸变为羟脯氨酸,该反应在前胶原多肽链折叠成稳定的三螺旋结构的过程中发挥重要作用。P4H的同工酶P4Ha1在多种组织中均有表达,其表达减少可导致斑块内胶原含量减少,进而导致AS斑块不稳定,因而是决定斑块稳定性的重要因素。既往研究发现多种因素均能影响P4Ha1的表达,例如TGFβ1能够上调P4Ha1的表达而吸烟可抑制其表达；本实验室也曾发现炎症因子TNF-α和IL-6分别通过ASK1-JNK-NonO和ERK1/2-Sp1信号通路抑制P4Ha1的表达。 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)是动脉粥样硬化形成和发展过程中的重要危险因素。研究发现ox-LDL能够激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs),增加胶原降解,进而诱导斑块不稳定。但是,ox-LDL能否通过调节P4Hα1的表达进而调节胶原合成目前尚未见报道。他汀类药物不仅具有降脂作用,还具有多种有益于心血管疾病的作用。大量研究证实他汀类药物能够增加斑块内胶原含量进而增加斑块稳定性,其机制为他汀类药物抑制MMPs的表达和活性以及增加了基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表达。然而,他汀类药物能否通过调节P4Hα1的表达进而调节胶原合成目前尚未见报道。 2研究目的 (1)探讨ox-LDL对P4Hα1的抑制作用及其机制并探讨辛伐他汀的干预作用； (2)观察辛伐他汀干预对斑块内P4Hα1表达的影响及并探讨其机制,揭示他汀类药物稳定动脉粥样硬化斑块的新靶点。 3实验方法 3.1细胞培养与处理 (1)在时间-效应实验中,我们用50ug/ml的ox-LDL刺激平滑肌细胞0、4、8、12和24小时,为保证ox-LDL不至于因为刺激时间过长而降解或者失活,每隔8小时更换含有50μg/ml的ox-LDL的新鲜培养基；在剂量-效应实验中,0、25、50ug/ml的ox-LDL分别刺激平滑肌细胞8小时,收集细胞。 (2)50ug/ml的ox-LDL或者50ug/ml的ox-LDL+辛伐他汀分别刺激细胞0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时,检测MAPK的激活。我们应用MAPK的抑制剂以及MAPK的小分子干扰RNA处理细胞,然后应用50ug/ml的ox-LDL刺激细胞8小时,收集细胞。 (3)在正常培养基或者ox-LDL刺激条件下,辛伐他汀干预细胞进行相关检测。 3.2动物模型的建立 120只8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为两组—普通饮食组(n=40)和高脂饮食组(n=80)。2周后,所有小鼠均给予右侧颈总动脉套管以促进AS斑块形成。套管术后6周,普通饮食组随机分为两组(每组20只)Mockl组(0.5%methylcellulose单独灌胃)和Sim1组(辛伐他汀溶于0.5%甲基纤维素,50mg/kg·d量灌胃)；高脂饮食组随机分为四组(每组20只)Mock2组(0.5%甲基纤维素单独灌胃),SB组(p38MAPK抑制剂SB203580,2mg/kg·d腹腔注射),PD组(ERK1/2抑制剂PD98059,2mg/kg·d腹腔注射),Sim2组(辛伐他汀溶于0.5%甲基纤维素,50mg/kg·d量灌胃)。治疗6周后对小鼠称重行安乐死。 3.3RT-PCR 收集细胞,提取mRNA,检测P4Hα1mRNA水平。 3.4Western blot 收集细胞和颈动脉斑块组织,提取蛋白,检测P4Hα1、I型胶原和Ⅲ型胶原、P-/T-p38MAPK、P-/T-JNK、P-/T-ERK1/2的表达。 3.5ELISA 收集细胞上清,ELISA试剂盒检测上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量。 3.6Dil-ox-LDL摄取实验 DiI-ox-LDL刺激细胞8小时,激光共聚焦照相观察细胞摄取情况。 3.7血脂检测 动物试验结束前,收集小鼠空腹血清,检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。 3.8H&E、油红O、天狼猩红染色以及MOMA-2、α-SM actin和ox-LDL的免疫组化染色 制备颈动脉斑块冰冻组织切片,行H&E染色观察大体形态,油红O染色检测脂质含量,天狼猩红染色检测胶原含量,MOMA-2和a-SM actin染色分别检测巨噬细胞和平滑肌细胞含量,计算易损指数。免疫组化染色检测斑块内ox-LDL的含量。 4结果 4.1细胞实验 4.1.1ox-LDL对P4Hαl的抑制作用 在时间-效应实验中,50ug/ml的ox-LDL能够抑制P4Hα1的表达,在8小时时间点达到最大抑制效应；在剂量-效应实验中,随着ox-LDL浓度升高,P4Ha1的mRNA和蛋白水平呈递减趋势,在50ug/ml达到最大抑制效应。我们也应用Western blot和ELISA检测了ox-LDL刺激细胞8小时后胶原的含量,结果显示ox-LDL显著抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达和分泌。 4.1.2ox-LDL通过激活p38MAPK和ERK1/2信号通路发挥抑制作用 Ox-LDL刺激平滑肌细胞0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时,检测MAPK激活。结果发现p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平在5分钟达高峰,之后虽然逐渐减弱,但在8小时仍显著高于0分钟时,说明ox-LDL对其激活可持续至8小时。但是,ox-LDL对JNK的磷酸化水平无明显影响。应用p38MAPK、JNK和ERK1/2的抑制剂或者siRNA处理细胞,然后应用ox-LDL刺激细胞检测P4Hal的表达,发现抑制或基因沉默p38MAPK和ERKl/2后ox-LDL对P4Hα1的抑制作用明显减弱,而JNK的阻断或者基因沉默对P4Hα1的表达无显著影响。 4.1.3辛伐他汀逆转ox-LDL对P4Hα1的抑制作用 辛伐他汀不能改变正常情况下平滑肌细胞P4Hα1的表达水平,但是可以显著逆转ox-LDL刺激细胞对P4Ha1的抑制效应,相应的增加了胶原的合成。探讨其机制发现辛伐他汀能够减少细胞对ox-LDL的摄取,抑制p38MAPK和ERK1/2的磷酸化。 4.2动物实验 4.2.1动物体重及血脂水平 各组ApoE-/-小鼠的体重无显著差异。高脂饮食小鼠TC、TG、LDL-C较普通饮食小鼠显著升高而HDL-C显著降低；高脂饮食组内的四个亚组间各血脂指标无显著差异。 4.2.2辛伐他汀、SB203580和PD98059增加AS斑块稳定性 普通饮食组内,辛伐他汀干预未显著改变斑块的易损指数。与Mockl组相比,Mock2组AS斑块的易损指数显著升高,提示动脉粥样硬化易损斑块造模成功。在高脂饮食组内,辛伐他汀、SB203580和PD98059干预能够显著降低斑块的易损指数。 4.2.3辛伐他汀上调不稳定斑块内P4Ha1 与Mockl相比,Mock2组P4Ha1的表达水平显著降低,提示不稳定斑块内P4Ha1生成减少。在普通饮食组内,辛伐他汀干预未明显改变P4Ha1的表达。但是,在高脂饮食组内,辛伐他汀、SB203580和PD98059干预显著增加斑块内P4Hα1的表达水平。与Mock2组相比,辛伐他汀治疗还能够降低斑块内ox-LDL的含量,抑制p38MAPK和ERKl/2的磷酸化。 5结论 (1) ox-LDL通过激活p38MAPK和ERK1/2信号通路抑制P4Ha1和胶原的合成。 (2)他汀类药物能够逆转ox-LDL对P4Hα1的抑制作用,其机制是他汀类药物减少了细胞对ox-LDL的摄取,抑制p38MAPK和ERKl/2的激活。 (3)在ApoE-/-小鼠模型中,他汀类药物可增加AS斑块内P4Hα1的表达和胶原合成,达到稳定斑块的作用。本研究揭示了他汀类药物稳定斑块的新的干预靶点,具有重要的学术意义。 1研究背景 急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)是引起急性心脑血管事件的主要原因。目前已证实动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)易损斑块破裂是ACS发病的始动环节。研究发现易损斑块具有以下特点：较大的脂核、较薄的纤维帽、多种炎症细胞聚集以及斑块内胶原合成降解失衡。其中,胶原代谢是影响斑块稳定性的重要原因。 4羟基-脯氨酸羟化酶(P4H)是所有己知的21种胶原合成过程中的关键酶,能够催化X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)重复序列中的脯氨酸变为羟基脯氨酸,从而促进前胶原多肽链折叠成稳定的三螺旋结构。作为P4H的同工酶,P4Hα1是胶原合成过程中的重要限速酶。抑制P4Hαt1的表达可减少AS斑块内胶原合成,进而导致易损斑块形成；与之相反,过表达P4Hα1则会促进胶原的合成。既往研究发现TGFβ1能够促进P4Hα1的表达而吸烟可抑制其表达。近年来,本实验室张澄等研究发现在人类主动脉平滑肌细胞中,TNF-a具有抑制P4Ha1表达的作用,并提出了完整的信号转导通路即ASK1-MKK4-JNK1-NonO,首次提出NonO是P4Hal合成的重要转录因子,在调节胶原合成过程中发挥重要作用,但是目前尚缺乏动物实验验证。 NonO(即人类的p54nrb蛋白)是一个大小为54KDa并在体内广泛表达的蛋白,是一个无POU结构域的八聚体结合蛋白,NonO含有两个核酸结合域,可直接与DNA结合参与转录调控；另外,NonO也可与其他转录蛋白相互作用调节基因表达。如前所述,本实验室研究发现NonO是P4Hal合成的重要转录因子,在调节胶原合成过程中发挥重要作用。既往研究还发现NonO参与调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)信号通路,而该信号通路可参与炎症反应,促进TNF-α、IL-2、IL-6等炎症因子的表达；另外,NonO能够参与COX-23'-UTR的多聚腺苷酸化,影响其转录,而COX-2亦参与了炎症反应和AS的进展。上述研究提示NonO可能参与调节胶原代谢和炎症反应。综合国内外研究现状,NonO在AS中的作用研究尚未明确。对于大多数急性心血管事件来说,易损斑块的稳定性是影响事件的决定性因素,但目前,NonO是否影响易损斑块的稳定性尚无报道。 2研究目的 (1)体内实验中,通过过表达和基因沉默NonO观察NonO对易损斑块破裂率的影响以及斑块内成分的改变。 (2)体外实验中,通过过表达和基因沉默NonO探讨NonO稳定斑块的分子机制。 3方法 3.1NonO干扰及过表达慢病毒载体的构建 构建三个干扰(si-A、si-B、si-C)和一个过表达NonO的慢病毒载体,以携带乱序siRNA的慢病毒载体作为干扰对照,以只携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体作为过表达对照。转染RAW264.7细胞筛选最佳的干扰序列以及验证携带NonO基因的慢病毒的过表达效果。 3.2动物模型的建立 (1)20只8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养2周后,随机分为两组：Control组(Il=10)：无颈动脉套管及精神应激；Mock组忙=10)：行颈动脉套管手术,手术8周后行精神应激,具体方法如下：将ApoE-/-小鼠置于容积为50ml、带有通气孔的塑料针管中,同时进行噪音刺激。噪音刺激强度为110dB,每5分钟一次,每次持续3秒。每天持续6小时,共应激四周。实验第14周末,ApoE-/-小鼠被处以安乐死。 (2)为观察慢病毒转染效率及时间变化,15只ApoE-/-小鼠行颈动脉套管手术后八周,颈动脉局部转染携带GFP基因的慢病毒,并分别于转染前(n=5)、转染pGC-GFP-LV后2周(n=)和转染pGC-GFP-LV后4周(n=5)进行取材,观察各个时间点慢病毒转染效率。 (3)8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养2周后,右侧颈总动脉套管诱导AS斑块形成。颈总动脉套管手术8周后,根据转染病毒的不同,将ApoE-/-小鼠随机分为5组：(1) Control组(不加干预)；(2) si-N.C组(转染携带乱序siRNA的慢病毒、；(3) si-NonO组(转染携带si-NonO的慢病毒)；(4)N.C组(转染只携带GFP的慢病毒)；(5)NonO组(转染携带NonO基因的慢病毒)。转染后第3天开始应激刺激,刺激方法同前。实验第14周末,ApoE-/-小鼠被处以安乐死。 3.3体重及血脂的检测 实验开始前和14周末对所有ApoE-/-小鼠行体重测量,每只小鼠测量3次后取其平均值。实验14周末穿刺左心室采血,常温静置30分钟以后置于离心机中3000转离心15分钟,取上层血清,酶法检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的浓度。 3.4组织病理学的检测 制备右侧颈总动脉切片,对颈总动脉斑块进行H&E、油红O和天狼猩红染色并应用免疫组织化学染色的方法检测颈总动脉斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞、IL-1β、IL-6、MMP-2和MMP-9的含量,计算易损指数。 3.5细胞培养 (1)在时间梯度实验中,RAW264.7细胞应用100ng/ml的TNF-α分别刺激0、6、12、24和48h；在剂量梯度实验中,我们应用0、25、50和100ng/ml的TNF-α刺激RAW264.7细胞24h。收集细胞提取蛋白检测NonO表达水平。 (2)根据转染病毒的不同,将细胞分为5组：①Control组：不加任何干预；②si-N.C组：转染携带乱序siRNA的慢病毒；③si-NonO组：转染携带si-NonO的慢病毒；④N.C组：转染只携带GFP的慢病毒；⑤NonO组：转染携带NonO基因的慢病毒。100ng/ml的TNF-α刺激24小时,收集细胞。 3.6实时定量PCR 收集右侧颈总动脉组织,提取mRNA,检测颈动脉斑块内NonO、MMP-2和MMP-9的mRNA水平。 3.7Western blot 收集右侧颈总动脉斑块组织和细胞,提取蛋白,检测颈动脉斑块内NonO. MMP-2、MMP-9、P4Hα1、LOX-1、COX-2以及平滑肌细胞内NonO、MMP-2.MMP-9、IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、p/t-NF-κB p65以及IκBα的蛋白表达水平。 3.8细胞免疫荧光化学 细胞免疫荧光化学法检测五组RAW264.7细胞内NF-κB的核转位情况。 3.9免疫共沉淀 收集细胞蛋白,检测TNF-α刺激RAW264.7细胞后NonO与NF-κB的结合情况。 4结果 4.1AS斑块内以及TNF-α刺激的RAW264.7内NonO的表达水平 在体内实验中,与Control组正常的颈动脉相比,Mock组小鼠颈动脉斑块内NonO mRNA及蛋白表达显著升高,提示NonO在斑块进展中可能发挥作用。 在体外实验中,时间梯度实验显示100ng/ml TNF-α能上调NonO的表达,在24小时达到最大效应；浓度梯度实验显示10ng/ml TNF-α刺激24小时便能显著提高NonO的表达,在100ng/ml时达最大效应。 4.2RAW264.7细胞中慢病毒干扰及过表达NonO的效率和效果 将N.C、si-A、si-B、si-C及NonO-LV分别转染小鼠RAW264.7细胞,转染4天后观察慢病毒携带的报告基因GFP的表达情况,发现感染效率均大于70%进而收集细胞提取蛋白质进行检测。结果表明,si-A、si-B、si-C转染致NonO蛋白表达分别减少57%、43%和44%,进而筛选出最有效的干扰位点si-A用于随后动物和细胞实验中si-NonO组的转染；而NonO-LV转染细胞能够使NonO蛋白水平较Control组增加70%,用于随后动物和细胞实验中NonO组的转染。 4.3慢病毒在颈动脉斑块的转染效率 在颈动脉斑块局部转染慢病毒开始前、2周末和4周末取材,发现转染两周后GFP显著表达,然后开始衰减,4周末斑块内仍可见GFP表达,但是较2周前已有减弱。 4.4颈动脉斑块内NonO干扰及过表达效果 留取颈动脉斑块组织,检测斑块内NonO的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,si-NonO组NonO的]mRNA和蛋白水平较Control组分别下降了47%和43%,而NonO组则分别增长了61%和59%,但在si-N.C组和N.C组中NonO的mRNA和蛋白水平与Control组相比无显著差异。 4.5实验动物一般情况 实验各组ApoE-/-小鼠均顺利完成实验,慢病毒转染小鼠中未观察到明显的局部和全身性的不良反应。各组ApoE-/-小鼠的体重无显著性差异,血清中TC、 TG、LDL-C和HDL-C的浓度亦无发现显著统计学差异。 4.6NonO对AS斑块破裂率的影响 通过对连续组织病理切片的H&E染色分析,我们发现Control组、si-N.C组和N.C组各有46.67%(7/15),si-NonO组有13.33%(2/15),NonO组有66.67%(10/15)的AS斑块发生破裂。统计分析显示,si-NonO组斑块破裂率显著低于Control组,而NonO组斑块破裂率则显著高于Control组;Control组、si-N.C组和N.C组三组间斑块破裂率无统计学差异。含铁血黄素染色进一步验证了斑块破裂。 4.7NonO对AS斑块成分及其易损性的影响 与Control组相比,si-NonO组的斑块内巨噬细胞含量、脂质含量和易损指数显著降低,而平滑肌细胞含量和胶原含量显著升高；NonO组结果与si-NonO组相反。Control组、si-N.C组和N.C组间上述指标无显著差异。 4.8NonO对P4Hα1表达的影响 体内实验显示,Control组、si-N.C组和N.C组三组间颈动脉斑块内P4Hα1的蛋白表达无显著差异。与Control组相比,si-NonO组颈动脉斑块内P4Hα1的蛋白水平显著增高,而NonO组则显著降低,说明NonO参与抑制P4Hα1的表达。 4.9NonO对基质金属蛋白酶表达的影响 在体内实验中,si-NonO组颈动脉斑块内MMP-2和MMP-9的mRNA水平显著低于Control组；免疫组化和western blot检测也证明MMP-2和MMP-9蛋白水平在si-NonO组显著降低,而NonO组MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白水平较Contro组显著升高。Control组、si-N.C组和N.C组三组间MMP-2和MMP-9表达水平无显著差异。体外Western blot结果与该结果一致。同时,我们也检测了RAW264.7细胞刺激后MMP-2和MMP-9活性的改变,结果发现与Control组相比,si-NonO组MMP-2和MMP-9活性均显著降低,而NonO组则显著升高。4.10NonO对炎症因子的影响 在体内实验中,免疫组化分析显示si-NonO组的炎症因子IL-1β和IL-6的蛋白水平较Control组显著降低,而NonO组则显著增加IL-1p和IL-6的蛋白表达；western blot结果显示si-NonO组的LOX-1和COX-2的蛋白表达显著低于Control组,而NonO组LOX-1和COX-2的蛋白表达则显著升高。在体外实验中,Western blot结果显示与Control组相比,si-NonO组IL-1β、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1均显著降低,而NonO组则显著升高。 4.11NonO与NF-κB的相互作用 免疫共沉淀检测发现TNF-α能够增加NonO与NF-κB的结合。细胞免疫荧光染色显示与Control组相比,si-NonO组NF-κB的核转位显著降低,而NonO组NF-κB的核转位显著增强。Western blot检测显示si-NonO组的NF-κB磷酸化水平较Control组显著降低,而NonO组显著升高；IκBα的变化趋势与NF-κB磷酸化水平的变化趋势相反。 5结论 (1)首次发现NonO在动脉粥样硬化硬化斑块中高表达。 (2)在ApoE-/-小鼠易损斑块模型中,NonO降低斑块稳定性,增加斑块的破裂率,而NonO基因沉默后斑块稳定性增强,破裂率降低。 (3) NonO降低斑块稳定性的机制为增加MMP-2和MMP-9的生成,减少P4Ha1的表达以及抑制NF-κB介导的局部炎症反应。 1研究背景 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一组易感基因和危险因素共同作用导致的血管疾病。糖尿病(dibetes mellitus, DM)是AS最重要的危险因素之一。鉴于DM在AS中的重要作用,DM己作为冠状动脉粥样硬化性心脏病的等危症。DM可引起心肌梗死和脑卒中等大血管疾病,也可引起慢性肾病即糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)和神经病变等微血管疾病。多项大规模的临床试验结果表明,积极控制糖尿病患者的血糖水平有助于减轻微血管病变,但无助于改善大血管病变,提示两种血管病变的发生机制可能不同。因此,进一步探讨糖尿病微血管病变的发生机制和干预靶点具有重要的临床意义。由于DN是公认的糖尿病微血管病变,因此本文选择DN作为研究对象。 研究发现肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)在DN的发病过程中起了关键作用,应用ACEI/ARB可有效的缓解糖尿病的肾脏损伤,但是并不能达到预期效果,因此,寻找RAS系统新的干预靶点以有效缓解DN成为亟待解决的问题。ACE2是ACE的同源物,本实验室研究发现ACE2及其产物Ang(1-7)能有效阻止AS的发生发展；由于糖尿病是冠心病等危症,我们因此又应用外源性ACE2干预糖尿病大鼠模型,发现ACE2也显著改善了DM心脏功能并减轻了糖尿病肾脏损伤。目前已有大量的证据证实ACE2能够延缓DN的发展,然而,作为ACE2的主要产物,Ang(1-7)在DN中的独立作用仍不明确。因此,深入研究其在DN中的作用对于认识DN的发病机制以及DN的治疗具有重要意义。 Ang(1-7)是一种7肽,是RAS系统中一种重要产物。在肾脏组织内,Ang(1-7)主要由ACE2水解AngII生成,在维持肾脏内环境稳定中发挥重要作用。AngII可通过多种机制促进...