白藜芦醇保护神经干细胞氧糖剥夺损伤的实验研究

实验一、化学自调控缺氧盒的设计及应用 【研究背景】近年来，缺血性脑卒中发病率成明显的上升趋势，因此对缺血性脑卒中进行有效的防治具有及为重要的意义。明确其细胞分子机制是研究防治缺血性脑损伤的关键。细胞体外培养氧糖剥夺模型是目前最常用的模拟机体缺血、缺氧的实验方法，缺氧条件的构建是细胞氧糖剥夺实验的先决因素。目前，常用的缺氧细胞培养设备是无氧孵箱，其主要的工作原理是通过无氧混合气体替换出孵箱中的空气来实现缺氧。然而，无氧孵箱的体积大，无氧气体替换空气的效率较低，并需要持续通入无氧气体才能维持缺氧状态。设计一种简单、便携、易操作并且能自动地维持缺氧状态的缺氧盒成为迫切需求。 焦性没食子酸水溶液在常温条件下相对稳定，而其碱性溶液能够快速地与空气中的氧发生反应，这一特点明显有别于其他氧气清除剂。因此，用焦性没食子酸与氢氧化钠构成的碱性溶液作为氧气清除剂，是一较为理想的选择。 细胞培养需要稳定的酸碱环境，Na2HPO4/NaH2PO4和NaHCO3/H2CO3是常见的水溶液缓冲对，缓冲液能够维持其溶液稳定的PH值环境，稳定的二氧化碳浓度与溶液中NaHCO3能够维持一个相对稳定的PH值。 我们应用这些物理和化学特点设计了一种简易的化学自动调控缺氧盒，该缺氧盒既能满足缺氧、也能满足二氧化碳浓度的要求。 【目的】设计一种化学自调控缺氧细胞培养盒，并探讨其可行性和实验使用方法。 【方法】将1.5L密封盒改装成缺氧盒。将11.5g氢氧化钠和2.6g碳酸钠溶于55ml水中，18g焦性没食子酸溶于100ml水中，先后注入到密封真空输液袋内，配成焦性没食子酸碱性溶液，并将焦性没食子酸碱性溶液输注到缺氧盒内，要求加注时间不超过2min，用来快速地清除培养盒内的氧气。30min后再将47.8g二水磷酸二氢钠溶于110ml水中，并注入到缺氧盒内。NaH2PO4与氢氧化钠、碳酸钠化学反应用部分生成Na2HPO4，Na2HPO4/NaH2PO4构成基础缓冲对，维持化学反应液的PH值。碳酸钠之后部分生成NaHCO3和H2CO3，并进一步通过NaHCO3/H2CO3缓冲对维持缺氧盒内二氧化碳浓度，在化学反应液中Na2HPO4/NaH2PO4的量远大于NaHCO3/H2CO3。因此，二氧化碳的释放对化学反应液的pH值影响较小。用测氧仪检测盒内氧气浓度，并以二氧化碳测量仪检测二氧化碳的浓度，应用pH仪测化学反应液的pH值，再用血气分析仪检测细胞培养基的pH值。以U87、U251和骨髓间充质干细胞为实验细胞，对照组将盒内持续通入95%N2+5%CO2混合气体使氧浓度低于0.2%，CCK-8测量缺氧盒组与95%N2+5%CO2组细胞活性进行比较。每一组实验指标均重复5次。 【结果】将18g焦性没食子酸、11.5g氢氧化钠和2.6g碳酸钠配成的碱性吸氧液注入到缺氧盒内并计时，测量盒内氧气的体积浓度，在5min时氧浓度为0.592%±0.0798%，10min为0.238%±0.0278%，15min为0.200%±0.02236%，30min为0.194%±0.01342%，24h为0.194%±0.0321%。氧浓度在10min后趋于稳定，10min、15min、30min、24h相互比较无明显差异（P>0.05）。30min时将磷酸二氢钠溶液注入到盒内，24h时测量盒内二氧化碳浓度为5.03%±0.19%，化学反应液pH值为7.93±0.026。在密封条件下抽取细胞培养基测量pH值，于15min，30min，1h和24h的结果分别为：7.402±0.0156,7.341±0.0354，7.308±0.0365和7.311±0.0304。除15min细胞培养基pH略升高外，其余时间点的细胞培养基pH值均无明显变化，维持在7.0-8.0之间。采用U87、U251和骨髓间充质干细胞作为实验细胞，以95%N2+5%CO2替换盒内气体为对照（氧浓度低于0.2%），所致的细胞损伤及细胞活性检测，均无明显差异（P>0.05）。 【结论】根据焦性没食子酸的特殊化学性质以及缓冲液的特点，设计的缺氧盒之缺氧效果好，盒内二氧化碳浓度稳定，经观察与95%N2+5%CO2组比较无明显差异，它能够满足缺氧实验的需求。 实验二、白藜芦醇预处理对神经干细胞氧糖剥夺损伤的保护作用 【研究背景】神经系统受损后修复能力有限，神经干细胞及神经前体替换损伤神经细胞为神经系统的修复提供了有利条件。但是，缺血性脑卒中及再通后，其内环境发生了较大的变化，这对干细胞的存活与生长会产生严重的影响。白藜芦醇（Resveratrol，Res）是多酚类药物，广泛存在于自然界植物中。研究发现，Res可以激活SIRT1，并通过SIRT1相关通路对细胞保护发挥作用，可提高神经细胞的耐缺氧能力。本课题从缺血损伤的基本因素出发，研究Res预防神经损伤的机制，以及增强神经干细胞生存能力的有效方法，将为神经损伤修复及神经干细胞的临床应用提供新的证据和研究思路。 【目的】探讨Res预处理对神经干细胞氧糖剥夺损伤的有效保护作用。 【方法】取自孕15dSD大鼠胎脑组织进行分离、培养，通过免疫组化鉴定巢蛋白表达情况，鉴定其神经干细胞的特性；用含有Res10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L培养液预处理，培养神经干细胞1h，同时对照组加入含0.1%DMSO培养液。更换低糖培养基后，将细胞置于本研究创用的缺氧盒内，进行培养氧糖剥夺的实验，时间为6h；采用四唑盐比色实验检测细胞活性；收集培养基上清，通过测量上清中乳酸脱氢酶活性，检测细胞损伤情况。 【结果】原代胎鼠脑组织分离培养5d后可见神经球形成，细胞爬片及神经球免疫组化鉴定结果，见巢蛋白表达阳性，所培养的细胞为神经干细胞；Res处理1h后OGD6h测细胞活性。10μmol/L和20μmol/L组MTT值相对于对照组有统计学意义（n=7,p<0.01），表明10μmol/L和20μmol/LRes预处理1h对神经干细胞耐氧糖剥夺损伤有保护作用；20μmol/L组LDH活性相对于对照组有统计学意义（n=5,p<0.01）,细胞损伤较轻。 【结论】Res预处理1h对神经干细胞氧糖剥夺损伤有保护作用，并可提高神经干细胞的活性，明显地减轻了细胞损伤所造成的LDH渗出。