隐孔菌发酵物及多糖的制备与抗炎活性的研究

隐孔菌为隐孔菌科隐孔菌的子实体,有舒筋活络,祛风除湿的功效,在民间用于治疗气管炎和哮喘。隐孔菌早在公元15世纪《滇南本草》就有记载。因该菌为腐生真菌,生态环境严格,以致蕴藏量少,资源紧缺,故采用发酵培养技术来获得隐孔菌的新药研发资源。通过与野生隐孔菌比较,发酵培养获得的隐孔菌的化学成分和理化性质基本上与野生隐孔菌相似。经过一系列药理和急性、慢性毒性研究证实,隐孔菌发酵物（CFS）有明显的抗炎平喘作用,无明显毒性反应,是一种很好的治疗哮喘的中药新药。 本论文共分以下4部分工作: 1、隐孔菌发酵物的制备与抗炎活性研究:研究隐孔菌发酵物的制备工艺,明确其抗过敏性炎症的作用。实验结果表明,隐孔菌发酵的适宜培养基组成为:碳源为葡萄糖,氮源为蛋白胨、酵母膏,并添加磷酸盐、硫酸镁等无机盐,调pH值至4.8～5.0。培养条件为27～28℃,140r/min,摇床振荡培养4～5天。正交实验结果表明,培养基各组成成分的最佳比例:葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、KH2PO40.1%。发酵试验结果表明,培养3～5天时,还原糖降至0.6%左右,pH降至3.8左右,且菌丝浓度≥27%,即可终止发酵。上述指标可作为对发酵终点控制的指标。隐孔菌发酵工艺研究,建立了隐孔菌发酵最适培养基及培养条件,为隐孔菌发酵物的稳定生产提供依据。药理实验结果表明CFS灌胃给药呈剂量依赖抑制致敏大鼠抗原攻击后支气管肺泡灌流液中嗜酸性粒细胞升高,明显抑制嗜酸性粒细胞的聚集反应,同时也证明了CFS中有可被胃肠吸收的有效成份。 2、隐孔菌发酵物有效成分的药理筛选:研究隐孔菌发酵物中生物碱类物质、有机酸类物质和多糖类物质的抗炎作用,寻找隐孔菌发酵物中具有抗炎药理作用的活性化学成分。实验结果表明,采用稀盐酸与生物碱反应生成盐的原理提取隐孔菌发酵物中总生物碱,每100g发酵物中含有生物碱0.13～0.20g;用乙酸乙酯提取隐孔菌发酵物中总有机酸,每100g发酵物中含有有机酸1.2～4.0g;用水提和乙醚脱酯法提取隐孔菌发酵物中总多糖,每100g发酵物中含有粗多糖2.0～6.5g。用大鼠哮喘模型的嗜酸性粒细胞为指标筛选这3个部分的作用,结果显示多糖成分的作用较强,作用强度依次为粗多糖＞发酵物＞生物碱＞有机酸。因此认为值得进一步深入多糖成分的研究。 3、隐孔菌多糖的制备及抗炎作用强度的药效研究:对隐孔菌多糖（CP）进行了纯化制备、含量测定、分子量分布研究,考察纯化隐孔菌多糖对致敏小鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中的炎症细胞的作用,并采用灌胃和静脉注射两种给药途径,通过药效比较初步阐明隐孔菌多糖的生物利用度和作用强度。实验结果表明,采用PEG沉淀多糖的提取方法,硫酸-蒽酮法测定隐孔菌多糖含量达到87%,从高效液相的分子量分布图来看,隐孔菌多糖含有一个不同于培养基的特征峰,分子量范围为2000～200000。色谱条件:G2000SWxl柱,流动相为0.7%硫酸钠溶液,流速0.5ml/min,柱温29℃,进样3μl,示差检测器。同时,发现纯化隐孔菌多糖不同给药方式以及不同给药剂量对小鼠哮喘模型支气管肺泡的炎症细胞聚集有明显的抑制作用。CP 2mg/kg iv,10mg/kg iv均能显著抑制嗜酸性粒细胞在支气管肺泡内聚集（P＜0.01～0.001）。CP灌胃给药的抗炎作用强度约为静脉注射给药的20～40%,同等剂量CP静脉注射作用强度约为灌胃给药的2.5～5倍。以上结果提示,CP可进一步纯化,经还原主要单糖为岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖。纯化的CP抗炎作用明显强于隐孔菌发酵物。 4、隐孔菌多糖对小鼠哮喘模型抗炎作用机制的初步探讨:研究小鼠抗原攻击后肺组织嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）mRNA以及α-肿瘤坏死因子（TNF-α）mRNA表达的时程关系以及CP对表达的影响,初步探讨CP对小鼠哮喘模型抗炎作用的机制。采用半定量RT-PCR法测定肺组织eotaxin mRNA和TNF-αmRNA表达,并通过观察支气管肺灌洗液（BALF）中白细胞总数和嗜酸性粒细胞的数目验证eotaxin和TNF-αmRNA表达增多的功能。研究结果表明,致敏小鼠抗原攻击8 h后肺组织TNF-αmRNA表达和24h后eotaxin mRNA表达达到高峰,与对照小鼠比较明显增多,BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数目相应增加。隐孔菌多糖CP3、10、30 mg·kg-1呈剂量依赖抑制TNF-α和eotaxin mRNA表达以及炎症细胞在气道的聚集。所以隐孔菌多糖抑制肺组织TNF-α和eotaxin mRNA表达可能是其抗过敏性炎症的作用机制。 结论: 1、通过发酵工艺优化研究,为得到稳定、优质的隐孔菌发酵物提供了实验依据。药理实验表明隐孔菌发酵物灌胃给药能明显抑制肺灌洗液中嗜酸性粒细胞的聚集反应,同时也证明了隐孔菌发酵物中有可被胃肠吸收的有效成份。 2、通过活性成分筛选实验,表明隐孔菌多糖类成分是主要的抗过敏性炎症成分之一。 3、纯化的隐孔菌多糖,抗炎作用明显强于隐孔菌发酵物。 4、纯化的隐孔菌多糖抑制肺组织eotaxin和TNF-αmRNA表达可能是其抗过敏性炎症的作用机制。