目的:本研究旨在利用全骨髓细胞培养系及破骨前驱细胞培养系,探讨丹参酮IIA对体外培养的破骨细胞形成及分化的影响,为以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病的治疗和预防提供一条新思路,为今后进一步深入研究破骨细胞打下基础。
方法:选用4周龄SD雄性大鼠,利用全骨髓细胞培养系及破骨前驱细胞培养系,在10-8M1α,25(OH)2D3和破骨细胞分化因子sRANKL存在下,进行体外细胞培养,观察丹参酮IIA对破骨细胞形成及分化的影响。
1细胞培养及药物添加:
1.1全骨髓细胞培养系:取4周龄SD雄性大鼠一只,用异氟烷麻醉后,无菌条件下取其胫骨和股骨,剪掉骨垢端暴露骨髓腔,然后用10ml注射器抽取不含血清的α-MEM培养液冲洗骨髓腔,提取全骨髓细胞,2000转/分离心5分钟后,加入含有15%胎牛血清的α-MEM培养液20ml,吹打混匀后形成细胞悬液,计算细胞数,算出细胞原液浓度,然后配制2×106cells/ml的细胞悬液13ml,添加活化型双羟维生素D3(1α,25(OH)2D3)和破骨细胞分化因子(sRANKL),使其终浓度分别为10-8M/ml和20ng/ml,然后用24孔培养板播种细胞,每孔加入2×106cells/ml的细胞悬液0.5ml(1×106cells)。细胞播种后,将培养板放入CO2培养箱内,在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养,培养至第4天时换培养液一次,共培养7天。
1.2破骨前驱细胞培养系:全骨髓细胞提取后,离心浓缩成1.5ml,然后注入葡聚糖凝胶G10(Sephadex G10)中过滤,除去骨髓间质细胞,搜集非附着性骨髓细胞12—15ml,然后计算细胞数,算出细胞原液浓度,配制细胞浓度为2×106cells/ml的细胞悬液13ml,添加活化型双羟维生素D3(1α,25(OH)2D3)和破骨细胞分化因子(sRANKL),使其终浓度分别为10-8M/ml和20ng/ml,然后用24孔培养板播种细胞,每孔加入2×106cells/ml的细胞悬液0.5ml(1×106cells)。细胞播种后,将培养板放入CO2培养箱内,在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养,培养至第4天时换培养液一次,共培养7天。
1.3药物添加:在播种有两种细胞培养系细胞的24孔培养板中添加丹参酮IIA,使终浓度分别为0,0.5, 1, 2, 5, 10ug/ml,共加4行6列,每行6个浓度,每个浓度每列4孔(n=4)。第一列0为对照组。
2抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:两种细胞培养系细胞在培养至7天后分别行TRAP染色,光镜下观察,计算TRAP染色阳性细胞数。全骨髓细胞培养系计算3核以上TRAP染色阳性细胞数。
3.统计学分析:使用SPSS16.0统计学软件进行分析。数据处理采用mean±SD表示,采用方差分析对不同药物浓度相同处理时间,各组与对照组之间相比较丹参酮IIA对破骨细胞形成及分化的影响,进行统计学分析。
结果:
1破骨细胞的形态学特征
1.1全骨髓细胞培养系:在全骨髓细胞培养系中,经TRAP染色后,可见到大量成熟破骨细胞,其形态学特征为:细胞体积大,呈椭圆形、条索形、漏斗形、油煎蛋形或不规则形。胞浆丰满呈紫红色,并伸出许多伪足样突起。细胞内可见到几个至几十个不等的细胞核,胞核不着色。细胞浆内可见到空泡。
1.2破骨前驱细胞培养系:在此培养系中,经TRAP染色后,可见到大量破骨前驱细胞,其形态学特征和成熟破骨细胞相似,只是细胞体积小,细胞核大多为单核,也可见到2核者。此类细胞为不成熟的破骨前驱细胞,如在破骨细胞分化因子刺激下,可相互融合,形成大的成熟破骨细胞。
2.丹参酮IIA对破骨细胞形成的抑制在全骨髓细胞培养系中,0.5、1、2ug/ml组与对照组比较,TRAP染色阳性细胞(3核以上)数仅为对照组的55.04%、25.18%、9.71%,经统计学分析,加药组对破骨细胞的形成有抑制作用,当药物浓度为1ug/ml时与对照组相比对破骨细胞形成有显著抑制(p﹤0.01)。
在破骨前驱细胞培养系中,0.5、1、2、5ug/ml组与对照组相比,TRAP染色阳性细胞(单核或2核)数仅为对照组的95.01%、70.93%、40.78%、2.39%,经统计学分析,加药组对破骨细胞的形成有抑制作用,当药物浓度为2ug/ml时与对照组相比对破骨细胞形成有显著抑制(p﹤0.01)。
结论:
1.丹参酮IIA直接作用于破骨细胞系列细胞,抑制其形成与分化。
2.丹参酮IIA对成熟破骨细胞及破骨前驱细胞的抑制作用在一定浓度范围内随药物浓度的增加,抑制作用增强。
