补肾调肝法治疗高龄原发性骨质疏松症的理论、临床与实验研究

目的： 在中医理论指导下,深入分析高龄原发性骨质疏松症(Primary Osteoporosis, POP)的中医临床症候特征,结合文献研究,探讨高龄POP的基本病机、治则及方药组成,研究从肝郁肾虚论治高龄POP的可行性与合理性,观察补肾调肝方治疗高龄POP的临床效果,并基于衰老理论,结合“肾藏精主骨生髓”、“肝肾同源”理论,立足Wnt/β-catenin信号转导通路,深入研究补肾调肝方对衰老骨髓间充质干细胞(Bone Mesenehymal Stem Cells,BMSCs)的影响及诱导其成骨分化的效应,探讨补肾调肝方抗骨质疏松的机制,为临床应用补肾调肝法治疗高龄POP提供新的理论和实验依据。 方法： 分三部分研究： 一、中医基本理论研究方面 从中医对POP的认识、中医对肝郁肾虚的认识、POP与肝郁肾虚的关系、POP从肝肾论治的途径、补肾调肝方的组方依据等方面,分析、探讨从肝郁肾虚论治高龄POP的可行性与合理性。 二、临床研究方面 (一)高龄POP患者的中医证候特征研究 选取166例在广州中医药大学附属骨伤科医院门诊或住院治疗的POP患者,收集临床信息,观察高龄POP的临床主要症状,分析中医证候特征。采用全身双能X线骨密度仪测量患者腰椎前后位骨密度(Bone Mineral Density,BMD)值,研究高龄POP患者病性、病位证素与BMD水平的相关性。 (二)高龄POP患者抑郁障碍的临床研究 采用老年抑郁量表(Geriatric Depression Scale,GDS)进行抑郁障碍评分,调查高龄POP患者并发抑郁障碍情况,分析高龄POP患者抑郁障碍发生的原因,研究高龄POP患者中医证候与抑郁障碍的相关性。 (三)补肾调肝方治疗高龄肝郁肾虚型POP的临床研究 随机选取在广州中医药大学附属骨伤科医院门诊就诊的POP患者80例,随机分为治疗组和对照组,治疗组给予口服补肾调肝方；对照组给予口服福善美。两组治疗时间均为4周。观察临床治疗效果、肝郁肾虚中医症候及疼痛改善情况。 三、实验研究方面 (一)大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定 贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,流式细胞仪检测BMSCs CD29、 CD44、CD34抗原表型。 (二)D-半乳糖诱导BMSCs衰老的研究 用D-半乳糖诱导制作BMSCs衰老模型,培养11天、21天做β-半乳糖苷酶染色,镜下观察细胞的形态和结构变化,确定衰老染色阳性衰老细胞数的百分比。 (三)补肾调肝方对BMSCs细胞增殖的影响 将BMSCs分为空白组及不同浓度补肾调肝方水提液中药组,MTT法检测不同浓度补肾调肝方水提液对BMSCs增殖的情况。 (四)补肾调肝方诱导衰老BMSCs成骨分化的研究 将培养成功的衰老BMSCs分为空白组、成骨诱导组和中药组,培养7d、14d后行矿化结节茜素红染色(Alizarin Red S,ARS),倒置显微镜下观察矿化骨结节形成情况。 (五)补肾调肝方对衰老BMSCs SAHF结构形成的影响 将培养成功的衰老BMSCs分为空白组、正常组和中药组,14天后行DAPI染色,激光共聚焦显微镜观察BMSCs SAHF结构形成情况。免疫组织化学及Western blot法检测各组BMSCs HIRA、 ASFla表达情况。 (六)补肾调肝方对衰老BMSCs Wnt/β-catenin信号转导通路的影响 将培养成功的衰老BMSCs随机分为空白组、成骨诱导组和中药组,7天后免疫组织化学及Western blot法检测BMSCs Wnt2、 β-catenin、 GSK3β表达情况,Western blot法检测BMSCs Phospho-S9-GSK3β (pGSK3β)表达情况。 结果： 一、中医基本理论研究方面 1.基于“肾主骨”、“肝肾同源”理论,提出“肝郁肾虚”是高龄POP的关键病机： (1)肾虚是高龄POP核心病机。 (2)肝郁是高龄POP重要病机。 (3)肝郁、肾虚相互影响,互为因果。 (4)筋骨并重是确立高龄POP肝郁肾虚型的基本体现。 (5)肝肾同源、肝肾同治是确立高龄POP肝郁肾虚证型的内在要求。 2.高龄POP属本虚标实,提出治疗的主要原则是补肾调肝,重要途径是“治用、治体、治少阴”,治用即疏肝气,治体即补肝血和养肝阴,治少阴就是填肾精、补肾阳、滋肾阴。 3.根据中医理论,参考专家经验,结合临床实践,筛选中药,确立补肾调肝方(碎补15g、狗脊15g、白芍30g、柴胡12g、郁金15g、当归15g、玫瑰花12g、川楝子12g、川芎10g、白术15g、合欢皮15g、菊花15g、菖蒲15g、甘草10g)。 二、临床研究方面 1.高龄POP患者的主要证候特点 166例高龄POP患者临床出现频率较高的中医症状是腰酸背痛、胸胁胀痛、精神抑郁、善太息、烦躁易怒、视物模糊、肢酸软痛、倦怠乏力、畏寒喜温、口苦、夜尿频数、耳鸣耳聋、面色晄白或萎黄。舌质淡或暗,舌苔少、苔白,脉沉细或沉弦。 2.高龄POP患者的病位证素分布特点 166例高龄POP患者病位证素属肾151例,属肝140例,属脾26例,属心10例,属肺5例。高龄POP患者组合脏腑定位在肝肾128例、脾肾15例、肝脾8例、肺肾5例、心肾3例、心脾3例、心肝4例。病位证素分布结果提示高龄POP病位主要在肝肾。 3.高龄POP患者的病性证素分布特点 166例高龄POP患者病性证素主要是气虚、气郁、血瘀、阴虚、阳虚。病性证素组合常见气郁血瘀、阳虚血瘀、气虚血瘀、阴阳两虚,血瘀多因气郁所致。 4.高龄POP患者的证候分析 综合分析高龄POP患者临床证候特点、病性、病位证素分布规律,判定高龄POP患者与肝肾密切相关,病性属本虚标实,以肝郁肾虚型最为多见。 5.高龄POP患者病性、病位证素与BMD水平的相关性研究 166例高龄POP患者病性、病位证素与BMD水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),提示高龄POP患者病性、病位证素与BMD水平没有直接相关性。 6.高龄POP患者抑郁障碍的发生情况 166例高龄POP患者发生抑郁障碍81例,发生率为48.80%,其中,轻度抑郁31例、中度抑郁22例、重度抑郁28例。 7.高龄POP患者抑郁障碍的原因分析 高龄POP患者抑郁障碍发生的原因主要有：躯体疼痛、心理对疾病的承受能力的下降、担心骨折的再次发生、担心生活不能自理、增加子女负担、医疗费用增加。 8.高龄POP患者中医证候与抑郁障碍的相关性研究 肝郁肾虚型与抑郁障碍关系最为密切,肝肾阴虚型易有抑郁障碍发病倾向。 9.补肾调肝方与福善美治疗高龄肝郁肾虚型POP的效果 治疗组32例,显效19例,有效9例,无效4例,总有效率87.50%,对照组31例,显效16例,有效10例,无效5例,总有效率83.87%,2组治疗总有效率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 10.补肾调肝方与福善美治疗高龄肝郁肾虚型POP疼痛改善情况 对照组31例,显效13例,有效10例,无效8例,总有效率74.19%；治疗组32例,显效13例,有效10例,无效9例,总有效率71.88%。2组有效率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 11.补肾调肝方与福善美治疗高龄肝郁肾虚型POP中医证候改善情况 对照组31例,痊愈11例,显效9例,有效6例,无效5例,总有效率83.87%；治疗组32例,痊愈16例,显效11例,有效3例,无效2例,总有效率93.75%。2组总有效率比较,差异有显著性意义(P<0.01),说明治疗组较对照组能更有效改善中医证候。 12.补肾调肝方与福善美治疗高龄肝郁肾虚型POP中医证候积分变化情况 2组治疗后与治疗前比较,中医证候积分降低,差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后2周、3周、4周,中医证候积分治疗组较对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),说明治疗组较对照组能更有效改善中医证候。 三、实验研究方面 1.大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定 BMSCs流式细胞仪免疫表型检测结果显示：CD29、 CD44高表达,阳性细胞比率分别为96.59%和93.86%,CD34低表达,阳性细胞比率分别为0.23%,符合BMSCs表型特征。 2.D-半乳糖诱导BMSCs衰老透视电镜观察 诱导组BMSCs呈现典型的衰老形态和结构变化,细胞体积稍大,细胞扁平、胀大、颗粒增多,核增大、染色深,核膜内陷,核染色质凝聚、固缩、碎裂,形成不同形状的块状；细胞质色素积聚,存在大量空泡,线粒体数量减少,体积增大或肿胀,内质网扩张；但细胞膜保持完整。正常组BMSCs核膜平整光滑,染色质分布均匀,胞浆内可见丰富的线粒体。 3.衰老染色检测D-半乳糖诱导BMSCs衰老的情况 BMSCs培养11天,正常组衰老率(23.97±7.89)%,诱导组衰老率(61.19±18.36)%,培养21天正常组衰老率(27.52±10.26)%,诱导组衰老率(78.81±21.73)%。D-半乳糖诱导培养11天、21天,诱导组BMSCs衰老明显,与正常组比较,差异有显著性意义(P<0.01)；D-半乳糖诱导培养21天较培养11天,BMSCs衰老显著,差异有显著性意义(P<0.01)；正常组培养21天较培养11天,BMSCs衰老不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。说明采用D-半乳糖诱导培养能建立良好的BMSCs衰老模型。 4.补肾调肝方对BMSCs细胞增殖的影响 补肾调肝方水提液干预24h、48h后,与空白组比较,浓度为10mg/ml、 lmg/ml的补肾调肝方水提液明显促进BMSCs增殖,浓度为100mg/ml的补肾调肝方水提液明显抑制BMSCs增殖,浓度在0.01mg/ml-0.1mg/ml范围内的补肾调肝方水提液对BMSCs生长无明显影响。干预24h后,浓度为10mg/m1与lmg/ml的补肾调肝方水提液对BMSCs增殖的影响差异无统计学意义(P>0.05),但干预48h与干预24h比较,lOmg/ml与lmg/m浓度的补肾调肝方水提液能明显促进BMSCs增殖,且10mg/m1较lmg/ml浓度的补肾调肝方水提液更能明显促进BMSCs增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。虽然浓度为10mg/ml的补肾调肝方水提液更能促进BMSCs增殖,但该浓度在体内较难以达到,推测其作用可能为假阳性,而浓度为lmg/ml的补肾调肝方水提液能明显促进BMSCs的增殖,因此确定将浓度为lmg/ml的补肾调肝方水提液用于下一步的实验研究。 5.补肾调肝方诱导衰老BMSCs成骨分化的研究 在成骨诱导剂、补肾调肝方水提液的作用下,衰老的BMSCs变宽、成多角形、多个细胞逐渐向中间聚拢,形成矿化结节。成骨诱导7d后行茜素红染色,与空白组比较,中药组、成骨诱导组钙化结节数量明显增多,差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)。14d后,空白组少见大量橘红色矿化结节形成,而中药组、成骨诱导组可见大量橘红色矿化结节形成,但中药组的矿化结节明显多于成骨诱导组。 6.激光共聚焦显微镜观察衰老BMSCs的SAHF结构形成情况 空白组见大量BMSCs的SAHF结构形成,而中药组、正常组少见有SAHF的形成,3组比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明补肾调肝方能减少衰老BMSCs的SAHF结构形成。 7. HIRA、 ASFla免疫组织化学染色及Western blot法检测 空白组衰老BMSCs HIRA、 ASFla的表达明显增强,而中药组及正常组表达较弱,表明HIRA、ASFla可能介导了BMSCs衰老进程,补肾调肝方可能通过下调HIRA、 ASFla的表达延缓BMSCs的衰老。 8. Wnt2、 β-catenin、 GSK3β免疫组织化学染色及Western blot法检测 空白组衰老BMSCs Wnt2、β-catenin的表达明显减弱,GSK3β表达明显增强,而成骨诱导组、补肾调肝方水提液中药组Wnt2、 β-catenin表达增强,GSK3β表达明显减弱,表明Wnt2、 β-catenin、 GSK3β在衰老的BMSCs成骨分化中起着重要作用,成骨诱导剂及补肾调肝方水提液通过上调Wnt2、 β-catenin表达、下调GSK3β表达促进衰老BMSCs成骨分化。 9. pGSK3β表达Western blot法检测 空白组衰老BMSCs pGSK3β的表达较低,而成骨诱导组及中药组表达较高,说明成骨诱导剂及补肾调肝方水提液能增加GSK3β蛋白磷酸化水平,抑制GSK3β活性,表明GSK3β磷酸化水平在衰老BMSCs成骨分化中起着重要作用。成骨诱导剂及补肾调肝方通过调控GSK3β磷酸化水平介导Wnt/β-catenin通路促进衰老BMSCs成骨分化。 结论： 1.高龄POP患者以肝郁肾虚证型为主,从肝肾论治高龄POP符合临床实际。 2.肝郁、肾虚与衰老、POP密切相关。高龄POP患者与衰老、抑郁障碍、BMSCs老化密切相关。 3.D-半乳糖具有诱导SD大鼠BMSCs衰老的作用,采用D-半乳糖诱导培养可建立BMSCs衰老模型。 4.补肾调肝方能有效减轻高龄肝郁肾虚型POP患者疼痛,明显改善中医症状,显著改善功能,疗效确切,无明显毒副作用,值得临床推广应用。 5.补肾调肝方促进衰老BMSCs的增殖效应与其下调HIRA.ASFla表达,减少SAHF结构形成,延缓BMSCs衰老有关。 6.补肾调肝方抗骨质疏松的机制之一是通过上调Wnt2. β-Catenin表达,下调GSK3β表达,增加GSK3β蛋白磷酸化水平,抑制GSK3β活性,活化Wnt/β-catenin通路促进衰老BMSCs成骨分化。