胶体金免疫层析快速检测氯霉素技术研究

氯霉素是一种广谱抗生素,广泛用于人和动物各种细菌性疾病的治疗,因其毒副作用较强,许多发达国家相继禁止或严格限制使用氯霉素,但传统的氯霉素残留分析方法需要昂贵的仪器和专业技术人员,且周期长、成本高,不能满足现场和快速检测的要求。因此,建立高效、灵敏、经济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。胶体金免疫层析试纸条检测法是利用抗原和抗体的特异性结合反应对微量抗原或抗体进行测定的方法,本论文旨在研制氯霉素免疫胶体金层析试纸条,应用于畜产品中氯霉素残留的快速检测,具有重要的现实意义和极高的商业开发价值。 采用活性酯法和重氮化法,将半抗原氯霉素与小牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,用紫外光谱、红外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定偶联结果并计算结合比。紫外扫描结果表明通过活性酯法和重氮化法研制的半抗原与BSA,OVA偶联物的摩尔消光系数分别为1.64×105、49402 ;3.73×105、46601,显著大于半抗原和载体蛋白。活性酯法制备的半抗原与BSA,OVA的偶联比分别为12,2;重氮化法制备的半抗原与BSA,OVA的偶联比分别为30,1。红外光谱分析确证了偶联成功。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,偶联物纯度较高。 运用合成的免疫原(Hap-BSA)多次免疫家兔,采集抗血清,制备出氯霉素多克隆抗体。通过竞争酶联免疫吸附分析方法证实该抗血清与琥珀氯霉素的交叉反应率为180%,与链霉素、四环素、土霉素、青霉素及克伦特罗等类似物的交叉反应率均小于0.01%,对氯霉素的检出限为0.01μg /L,具有较高的特异性和亲和力。 对柠檬酸三钠还原氯金酸制备的两种不同粒径的胶体金进行颜色、紫外扫描曲线和电镜扫描,结果表明, 16nm胶体金颗粒可用于标记抗体。通过紫外分析和试管观察试验确定了胶体金标记抗体的最适蛋白质浓度为24μg/mL,最适pH为7.6,且利用最低蛋白量和最适pH标记抗体制得免疫胶体金,经低温超速离心纯化和免疫渗滤检测,免疫胶体金具有氯霉素特异性。 胶体金垫是把吸光度为5 OD(520nm紫外扫描)的免疫胶体金均匀涂布于SB08型玻璃膜上,再冷冻干燥后制得。经比较试验选用Millipore公司的HF13504型硝酸纤维素膜作为层析膜;质控线采用稀释10倍的二抗(羊抗兔IgG);用浓度为0.225mg/mL的氯霉素包被原(CAP-OVA)喷涂检测线;样品垫、吸水垫均采用Millipore公司的专用材料。将胶体金垫、层析膜、样品垫、吸水垫组装制成免疫层析试纸条。 用制得的免疫层析试纸条检测已知的含有氯霉素的样品50个,灵敏度为1μg/mL,在其灵敏度范围内阳性率为100%,且层析条在6min左右出现清晰的条带,检测时间短,稳定性良好,符合快速检测要求。 对制备的氯霉素的免疫胶体金层析试纸条的验证试验表明,该试纸条对氯霉素的特异性强、操作简单、快速,适合于现场和批量样品的检测分析。