新加归肾丸对雷公藤多苷致卵泡发育障碍模型大鼠卵巢组织FOXO3a、HIF-1a、IGF-1R调控机制的研究

目的：本次实验基于课题前期研究,进一步探讨以补肾活血立法的新加归肾丸对雷公藤多苷所致卵泡发育障碍模型大鼠卵巢组织相关因子、蛋白影响的分子机制,以评价补肾活血法对卵巢局部环境的干预作用,为该法的临床应用提供客观依据。方法：选取动情周期正常的雌性SD大鼠76只,随机抽取18只为正常对照组给予蒸馏水灌胃,其余58只按照课题前期探索剂量,以雷公藤多苷75mg/(kg.30d)灌胃法复制卵泡发育障碍动物模型,造模结束后随机各取8只实验动物(共16只)以验证此次造模是否成功。后将造模成功大鼠随机分为5组,即模型空白组、中药高剂量组、中药低剂量组、定坤丹组、西药组,每组10只。模型空白组和正常对照组给予蒸馏水灌胃；中药各剂量组给予新加归肾丸高、低剂量治疗；西药组给予戊酸雌二醇和醋酸甲羟孕酮序贯治疗；定坤丹组给予定坤丹治疗；灌胃期间行阴道脱落细胞学检查。连续灌胃2周后股动脉采血,检测血清FSH、E2含量；采血后处死大鼠,开腹速取卵巢并称重,一侧立即置入10%中性甲醛液内保存,备行卵巢切片HE染色,另一侧置入液氮内保存备测IGF-1R、 FOXO3a、HIF-1a蛋白相对表达量(WB法)及IGF-1R、FOXO3a、HIF-lamRNA相对表达量(PCR法)。结果：(1)与正常对照组相比,模型空白组大鼠动情周期延长,体重变化率、卵巢湿重、卵巢指数下降,各级生长卵泡数、黄体数减少,闭锁卵泡数目增多。(2)与正常对照组比较,模型空白组血清FSH含量升高、E2含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型空白组比较,中药高剂量组、定坤丹组FSH含量明显降低、E2水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),其中以中药高剂量组效果最优。(3)与正常对照组比较,模型空白组FOXO3amRNA相对表达量升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型空白组比较,各药物治疗组FOXO3amRNA相对表达量均降低趋势,以中药高剂量组下降最明显,差异具有统计学意义(P<0.05)；其他各药物组差异无统计学意义(P>0.05)。(4)与正常对照组比较,模型空白组IGF-1 RmRNA相对表达量有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型空白组比较,中药高剂量组IGF-1 RmRNA相对表达量有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)(5)各组大鼠卵巢组织HIF-1amRNA相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。(6)与正常对照组比较,模型空白组IGF-1R、HIF-1a蛋白相对表达量降低、FOXO3a蛋白相对表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型空白组比较,各药物治疗组IGF-1R蛋白相对表达量升高、FOXO3a蛋白相对表达量降低,其中以中药高剂量组作用最明显(P<0.05),且作用优于西药组、定坤丹组；各药物治疗组之间差异无统计学意义(P>0.05)。各药物治疗组HIF-1a蛋白相对表达量较模型空白组均升高,其中以西药组、定坤丹组以及中药高剂量组作用最明显(P<0.05),中药低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)；各药物治疗组之间无明显统计学差异。结论：(1)补肾活血中药复方新加归肾丸可有效缩短模型大鼠动情周期,增加大鼠体重,卵巢湿重及卵巢指数,改善血清激素水平,恢复各级卵泡数及黄体数。(2)雷公藤多苷致卵泡发育障碍模型大鼠卵巢组织存在转录因子FOXO3a表达升高,HIF-1a、IGF-1R表达下降的失衡状态；补肾活血中药复方新加归肾丸可能通过升高模型大鼠卵巢组织中IGF-1R水平,上调HIF-1a的表达,下调促凋亡因子FOX03a的表达,从而抑制卵泡过度闭锁,促进卵泡正常生长发育。