Flavokawain A诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的机制研究

植物提取物Flavokawain A是从胡椒科植物卡瓦胡椒(Piper methysticum Forst)的干燥根中提取的活性成分,是一种新型抗癌化合物,但作用机制尚不明确。有报道显示,当今来源于植物的抗癌药物和抗炎免疫药物占新药的60%以上,从植物中提取抗癌化合物已经成为实验研究的热点。本实验研究Flavokawain A抑制人胃癌SGC-7901细胞生长、诱导细胞凋亡的机制,主要研究内容如下： 1Flavokawain A对胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响 通过MTT法,检测SGC-7901细胞经过系列浓度(0.781,1.56,3.13,6.25,12.5μg/ml) Flavokawain A作用24,48和72h后细胞的存活和生长状态,计算其IC5o值。在倒置显微镜下观察Flavokawain A作用前后,SGC-7901细胞在形态学特征上的变化。采用PI单染法观察Flavokawain A对细胞周期的影响,通过流式细胞仪定量测定细胞周期分布的变化。Flavokawain A对细胞凋亡的影响,则是采用Annexin V-FITC/PI双染法,通过流式细胞仪测定分析细胞凋亡率的变化。实验数据显示,SGC-7901细胞经过不同浓度(0.781,1.56,3.13,6.25,12.5μg/ml)Flavokawain A作用后,于24,48和72h后检测细胞抑制率,计算得出24,48和72h的IC50值分别为8.55,5.42,3.33μg/ml。细胞周期分布测定结果比较得出,Flavokawain A作用于SGC-7901细胞24h后,与溶剂对照组相比实验组细胞处于G2/M期的数量明显升高。细胞凋亡结果显示,早期凋亡率和晚期凋亡率均有不同程度的增加,6.255μg/ml Flavokawain A作用于细胞48h后,早晚期凋亡率分别为5.90%和5.44%。12.55μg/ml Flavokawain A作用于细胞48h后,早晚期凋亡率分别为14.37%和20.70%。 2Flavokawain A对caspase-9, caspase-3基因转录表达的影响 配制适宜浓度Flavokawain A培养基溶液,加入SGC-7901细胞培养,作用时间点到后采用Trizol法提取SGC-7901细胞中的总RNA,通过实时荧光定量PCR法检测caspase-9, caspase-3基因转录表达情况,与溶剂对照组进行比较,得出caspase-9, caspase-3基因转录水平存在不同程度的上调。 3Flavokawain A对caspase-9, caspase-3蛋白表达的影响 配制适宜浓度Flavokawain A培养基溶液,加入SGC-7901细胞培养,作用时间点到后采用Western Blot法检测caspase-9, caspase-3蛋白的表达情况,并与溶剂对照组进行比较。所得数据通过软件分析得出,caspase-9蛋白表达水平上调,caspase-3被激活。 4Flavokawain A的细胞动力学研究 配制适宜浓度Flavokawain A化合物培养基溶液,加入SGC-7901细胞培养,继续分别培养15,30,60,120,240min,时间点到后,经过样品前处理过程后采用高效液相色谱法对化合物进行定量分析。实验数据显示,Flavokawain A作用后,SGC-7901细胞在1-2h内对化合物的摄取量达到最大值。 5总结 本实验数据结果表明,Flavokawain A对SGC-7901细胞生长具有明显的抑制作用,抑制率随着化合物浓度及作用时间的增加而增大。经过Flavokawain A化合物作用后,对SGC-7901细胞的形态造成了明显的改变。通过对细胞周期的检测表明,Flavokawain A可将SGC-7901细胞阻滞于G2/M期,从而抑制细胞的生长。癌细胞的凋亡与癌症的治疗具有密切联系,通过对细胞凋亡的检测表明,Flavokawain A能够提高细胞的凋亡率。通过Western Blot和实时荧光定量PCR法检测Flavokawain A对caspase-9, caspase-3蛋白表达和基因转录表达的影响,可以推断SGC-7901细胞是通过线粒体途径诱导细胞凋亡的。