小柴胡汤及其拆方抗流感病毒作用的体外实验研究

目的 小柴胡汤出自《伤寒论》,由柴胡、黄芩、半夏、生姜、人参、炙甘草、大枣七味药组成,全方药虽七味,但配伍得当,组方严谨,具有寒热并用,攻补兼施,升降协调,和解少阳,疏利三焦,调达气机,宣通内外,运转枢机的作用。现代临床常用于呼吸系统疾病和传染病,如：上呼吸道感染、流行性感冒、不明原因发热、流行性腮腺炎、流行性结膜炎等。流行性感冒是由流感病毒所引起的急性呼吸道传染病,可造成世界性大流行。近年来由于流感病毒的肆虐,迫切需要新型的抗流感新药,而流感病毒的抗原又不断变异,使得西药难以发挥理想的作用。本课题的创新之处在于,将传统中医药理论与现代科学技术方法相结合,在前期体内实验的基础上,借助血清药理学和细胞培养技术,进一步通过体外实验,研究小柴胡汤及其配伍组对流感病毒的抑制作用,研究小柴胡汤及其拆方抗流感病毒的作用机制,以及各配伍组之间的药理协同作用机理。本实验研究对于揭示经方配伍治疗的科学性和严谨性,弘扬祖国传统中医药学,发掘祖国传统中医药学宝库,为临床用方提供有力的理论依据,都具有重要的意义。 方法 本实验应用血清药理学和细胞培养技术,研究小柴胡汤及各配伍组的细胞毒性和抑制流感病毒的作用。观察小柴胡汤全方组及其各配伍组对流感病毒肺适应株的抑制作用。具体方法如下： 1、将Wistar大鼠16只,随机分为8组,分别灌服相应组别药物,制备含药血清以备后期实验用。 2、猪肾细胞常规保存、传代,测定流感病毒滴度,得到病毒的TCID50,以备后期实验时使用。 3、含药血清对细胞的毒性测试：将8组含药血清分别加入单层细胞悬液中3天后MTT法,570nm波长比色测OD值,比较不同浓度含药血清对细胞生长的影响,以确定下一步实验中含药血清的加入量。 4、体外抗病毒作用观察：将100TCID50的甲型流感病毒液接种于长成单层的猪肾细胞上,置37℃、5%CO2培养箱内吸附2小时后,小心吸去病毒液,用PBS洗涤3次,分别加入最终浓度为10%的8组含药血清,每组设四个平行孔。药物与细胞作用3天后,MTT法570nm波长比色测OD值,计算抑制百分率。 结果 1、比较各组不同浓度的含药血清对猪肾细胞的毒性测定可以看出,各组药物随着含药血清浓度的增加细胞呈增殖生长。但各组除了在10%的浓度与正常对照血清组无差异外,在5%、20%、40%的浓度时均与正常对照血清组存在差异。可能是由于血清比例低时,各组含药血清中血药浓度偏低；血清比例高时,血药浓度已经饱和,而血清中的球蛋白在补体中或其它物质成分作用下,可产生细胞毒而对细胞有损害。为便于以下实验比较,确定下一步实验含药血清的浓度为10%。 2、小柴胡汤全方组对流感病毒有明显抑制作用,其他各拆方组中含有柴胡、黄芩的各组对流感病毒的抑制作用明显高于不含柴胡、黄芩的各组,表明小柴胡汤可以有效抑制流感病毒,柴胡、黄芩在抗流感病毒中发挥了重要的作用。 结论 应用血清药理学研究中药复方体外抗病毒实验,体外实验条件可控性强.药物效应易于检测、可深入揭示药物作用的机理；综合本实验结果,小柴胡汤具有明显的抗流感病毒作用,毒副作用小,其作用优于各拆方组；在小柴胡汤方剂中,以柴芩配伍的各组抗流感病毒的作用最强。表明在该方剂中,主要成分柴胡,黄芩在抗流感病毒感染环节中可能起着主要的作用,生姜、半夏、人参、大枣、炙甘草对流感病毒没有明显的抑制作用,但在整体抗流感病毒作用中不是完全没有作用,其机理有待在下一步实验中探讨。