沙冬青抗冻蛋白的分离纯化及特性鉴定

抗冻蛋白(AFPs，ntireeze roteins)是一类能吸附到冰晶表面并抑制其它水分子与冰晶结合的蛋白质。吸附到冰晶上的抗冻蛋白具有热滞活性和修饰冰晶形态功能，有利于降低组织细胞的冰冻损伤。测定热滞活性和观察冰晶形态是鉴定抗冻蛋白的两个重要指标。 利用改进的显微镜冰晶形态观察法，从豆科植物沙冬青(A．Mongolicus)冬季叶中分离纯化到两个抗冻蛋白：amAFP28和amAFP37，并对amAFP28的一些理化性质进行分析，为通过基因转化手段提高农作物抗冻性奠定基础。 用缓冲液Ⅰ(50mmol／L Tris-HCl，pH 8.0，10mmol／L EDTA，20mmol／L Vc)提取的冬季沙冬青叶粗提液，经一系列层析技术包括DEAE-cellulose A52弱阴离子交换层析、Superdex 75 prep grade分子筛层析和POROS20HP2灌注疏水层析，分离到具有抗冻活性的复合物：SDS-PAGE为34.7 kDa和37.1 kDa两条蛋白带。对SDS-PAGE电泳条带进行回收，活性检测表明，37.1 kDa蛋白带具有修饰冰晶形态功能，其热滞活性在5mg／mL蛋白浓度时为0.24℃(渗透压法)，此为amAFP37。 用缓冲液Ⅱ(25 mmol／L Tris-HCl，pH7.4，0.1 mmol／L EDTA，1mmol／L PMSF，0.1 mol／L KCl)提取的冬季沙冬青叶粗提液，在100℃加热15分钟后，经DEAE-cellulose A52弱阴离子交换层析、Sephacryl S300 HR分子筛层析、POROS20HP2灌注疏水层析和Source 15Q强阴离子交换层析，纯化得到热稳定抗冻蛋白amAFP28。amAFP28经SDS-PAGE测定分子量约为28kDa，其热滞活性在蛋白浓度为10mg／mL时为0.15℃(渗透压法)。amAFP28的pI为6.68，不含碳水化合物，其最大的紫外吸收值是278nm，最小的紫外吸收值是250nm。二硫键不是amAFP28抗冻活性所必需的。amAFP28富含亲水性氨基酸残基Asp，Thr，Glu以及小分子量氨基酸残基Ser，Ala和Val。圆二色谱(CD)显示amAFP28的二级结构组成为：α-螺旋17.2％，平行β-折叠和β-转角4.1％，反平行β-折叠39.7％，无规卷曲和γ-转角34.4％，-S-S-和芳香氨基酸4.6％。二硫键拆合对amAFP28的二级结构没有影响。amAFP28分子的N-端焦谷氨酰化封闭，测定的N-端氨基酸部分序列是GKSINHLPGQND。 冬季沙冬青叶非质体中有抗冻蛋白。