补阳还五汤对EAE小鼠的免疫调节作用研究

目的本课题应用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 35-55,MOG35-55)诱导C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）动物模型,模型建立后给予补阳还五汤干预,并观察其治疗EAE气滞血瘀证的临床评分、髓鞘修复能力、外周和中枢的免疫调节效应以及调控ROCK/TLR4/NF-κB炎症信号通路的细胞分子机制,阐明中药复方治疗EAE的靶点与途径,为临床应用益气活血法有效防治多发性硬化（multiple sclerosis,MS）提供理论和实验依据。方法采用MOG35-55多肽建立EAE模型后,将雌性C57BL/6小鼠随机分为生理盐水对照组、BYHWD组,每组16只。免疫后第3天开始,每天BYHWD组给予BYHWD（50g/kg）灌胃,对照组给予同等体积生理盐水。从免疫当日开始观察小鼠体重变化,并按国际通用标准监测、评定临床症状。发病高峰期p.i.17和p.i.28每组各处死8只,取脾脏、脊髓和脑。进行脊髓的病理染色,如HE、脱髓鞘染色。用免疫荧光染色的方法检测脊髓和脑内CD4+T细胞的表达,用Western blot观察脑、脾脏及脊髓ROCKII蛋白的表达,以及脊髓组织中TLR4、Myd88、NF-κB、cox-2的表达,流式细胞术检测脾CD4+T细胞亚群变化。用Graph Pad Prism 5软件对实验数据进行统计分析处理。结果1.免疫后第10天（p.i.10）EAE小鼠陆续开始发病。对照组小鼠均表现为纳少,活动减少,毛发无光泽,自汗,尾部逐渐拖地、双侧后肢无力甚至瘫痪,舌质紫暗,有大、小便失禁,出现明显的中医“痿症”。BYHWD组小鼠表现为纳可,活动频繁,仅有部分小鼠有尾部无力,舌质无紫暗,大、小便正常。与对照组比较,BYHWD治疗推迟临床发病时间（生理盐水的平均起病时间10.46±2.18,BYHWD治疗组平均起病时间为16.6±2.32,p<0.01）,显著改善EAE症状,降低临床评分（生理盐水组平均最高评分为3.62±0.46分,BYHWD治疗组平均最高临床评分为1.19±0.8,p<0.01）;对照组随着临床症状加重,体重减轻明显（15.67±0.35,p.i.28）;BYHWD组在临床症状改善的同时体重减轻较少（19.42±2.22,p.i.28）(p<0.001)。2.脊髓HE染色后,生理盐水组大量明显的炎性细胞浸润均分布在脊髓前角白质。对照组的炎性细胞浸润面积占白质的（9.95±5.36）%,BYHWD组为（2.25±1.29）%,BYHWD组的炎性浸润程度明显少于对照组,两组比较有统计学意义（p<0.01）。脊髓髓鞘染色可见对照组发生明显的髓鞘脱失,表现为神经髓鞘稀疏不连续,对照组髓鞘脱失占整个白质面积的比值为（27.69±8.44）%,BYHWD组为（8.28±3.02）%,BYHWD组髓鞘脱失较对照组减轻,两组比较时差异是有统计学意义的（p<0.001）。3.流式细胞术观察BYHWD对脾单个核细胞中T淋巴细胞亚型CD4+CD25+,CD4+IL-10+,CD4+IFN-γ+和CD4+TGF-β+变化的影响。结果显示:与对照比较,BYHWD可明显增强CD4+CD25+（对照组2.4%,BYHWD组5.47%,p<0.001）、CD4+IL-10+（对照组9.25%,BYHWD组14.30%,p<0.001）、CD4+TGF-β+（对照组6.37%,BYHWD组18.24%,p<0.001）、CD4+IFN-γ+（对照组6.34%,BYHWD组14.22%,p<0.001）的CD4+T细胞的表达（p<0.01）。4.脑和脊髓冰冻切片后利用免疫荧光染色分析发现,对照组在脑室内有大量CD4+T细胞浸润,在脊髓前正中裂处也有CD4+T细胞浸润,CD4+T细胞在脑内的浸润比脊髓中更明显。BYHWD治疗后抑制了脑和脊髓内CD4+T细胞的浸润（p<0.01）。5.Western blot法检测ROCK/TLR4/NF-κB炎症信号通路中相关蛋白的表达,与对照组比较,经BYHWD治疗后,EAE小鼠脊髓、脑及脾脏中ROCKII的表达均明显降低（p<0.01）;也同时降低脊髓内TLR4、Myd88、NF-κB、cox-2的蛋白表达水平（p<0.01）。结论BYHWD显示了它在早期治疗EAE的巨大潜能,效果明显。（1）BYHWD抑制CD4+T炎性细胞的迁移,减少炎性细胞进入CNS,使EAE炎症反应和脱髓鞘反应减轻;（2）BYHWD抑制了ROCK/TLR4/NF-κB炎性信号通路,减轻了EAE的炎性病理损伤;（3）BYHWD通过促进Th2细胞释放免疫抑制因子,增加调节性T细胞的比例,从而实现其对EAE的抗炎作用。