甘菊LEFAY同源基因的克隆与表达分析

LFY基因在植物花发育花过程中具有重要的作用,作为花分生组织决定基因,不仅决定着花由花序分生组织向花分生组织的转变,且超表达可以使植物的花期提前。此外,它还接连GA成花途径和长日途径的信号继而诱导花分生组织的转变,同时还是活化花器官基因的关键基因。我们根据LFY同源基因的结构特点设计特异性引物,利用5’和3’RACE获得了甘菊中LFY同源基因DFL。 DFL基因cDNA全长为1435bp包含一个ORF全长1239bp。编码412个氨基酸和一个终止密码子(Genbank登录号为AY559245,命名为DFL)。其推测的氨基酸序列中包含有一些转录因子的结构特征:脯氨酸富集区、中央酸性域、亮氨酸拉链结构及由赖氨酸和精氨酸残基形成的碱性域。氨基酸序列与金鱼草和拟南芥的同源性分别为70%和63%。 根据DFL基因的cDNA序列设计了两对跨越内含子区域的引物,通过基因组PCR,得到了甘菊中DFL基因的转录区基因组序列。基因组结构中包含有两个内含子和三个外显子:其中内含子1长为583bp,内含子2长1091bp,剪接点位置处的氨基酸与其它大部分植物的相同。 Southern杂交表明DFL基因在甘菊基因组中以单拷贝形式存在。 通过RT-PCR分析,发现DFL基因在甘菊的幼茎和幼叶中有少量表达,花芽中表达强烈,但在根中没有表达。 组织原位杂交表明甘菊成花时营养生长点、茎尖肥大期、总苞鳞片形成期、小花原基形成期及花冠形成时均有不同程度的表达。其中在萼片原基、总苞鳞片形成期的生殖锥中和雄蕊原基中强烈表达。在甘菊成花过程中起始开始到其发育成熟的整个过程中不同程度的表达量,这也表明它在甘菊成花的发育中起着重要作用。此外,包囊在花芽外面的正在发育的叶子中及成熟叶片的叶原基中,DFL基因也有表达。因此,组织位杂交的结果基本与RT-PCR相一致。 为了鉴定DFL基因的功能作用,构建了由35S启动DFL基因的正反义表达载体(载体中同时包含有由另外两个35S启动的潮霉素筛选基因和GUS组织化学染色基因)转化烟草。分子生物学和组织化学染色已鉴定出部分转化成功的植株。烟草的转化成功为进行菊花本身的转化奠定了一定的技术基础。