一、研究背景
肺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤,而且全世界肺癌发病率还在以每年0.5%的速度增长。肺癌中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占75—80%,其五年生存率仅为8—15%。手术切除仍是NSCLC的首选治疗,但大多数病人无法手术或仅可部分切除,3/4以上NSCLC病人在病程的某一阶段适合化疗或联合化傲疗。但目前最有效的化疗方案对晚期NSCLC的缓解率仅30%左右;寻求新的有效的肺癌治疗药物,进一步提高临床疗效,已成为当前迫切需要研究的课题之一。
重楼是中医中药抗癌配方中的常用药物,其应用已有上千年的历史。资料显示,重楼具有多种药理学活性,主要有抗菌消炎、止痛镇定及抗肿瘤作用,但是其总提取物或者单体提取物的抑制肿瘤的具体机制仍然不很清楚。重楼皂甙Ⅰ（polyphyllinⅠ,PPⅠ）是从重楼中提取出来的小分子单体,经前期研究发现它对肿瘤细胞有明显的杀伤作用;但是其对NSCLC细胞的作用尚不清楚。
本研究应用MTT试验、流式细胞术、免疫印迹、基因芯片、RT-PCR等技术和方法,深入研究重楼皂甙Ⅰ抗人NSCLC的可能机制。
二、材料与方法
1、培养三个NSCLC细胞株:人肺腺癌A549细胞株、人肺鳞癌SK-MES-1细胞株、人大细胞肺癌NCI-H460细胞株;MTr法检测不同浓度（0、0.625、1.25、2.5、10μg/ml）的PPⅠ对NSCLC细胞生长的抑制作用,选择合适的浓度及作用时间点进行后续实验。
2、DNA ladder检测2.5μg/ml的PPⅠ作用NSCLC细胞48h后对凋亡的作用,Western blot法检测2.5μg/ml PPⅠ作用24h后对NSCLC细胞procaspase-3和bcl-2表达的影响。
3、流式细胞技术（FCM）检测PPⅠ对NSCLC细胞周期的作用,流式细胞技术Annexin V-FITC法检测A549凋亡细胞。
4、对数生长期的A549细胞5×10～6个/只（100μl）接种于5周龄的BALB/c雄性裸鼠背部皮下,随机分成随机分为三组:PPⅠ组（11只）,顺铂（DDP）组（11只）和PBS对照组（11只）。接种第二天起开始经腹腔注射100μl的PPⅠ或DDP或PBS,给药剂量按PPⅠ:1.5mg/kg体重,DDP:1 mg/kg体重,一天两次,共10天。研究PPⅠ在体内对NSCLC生长的抑制作用。
5、采用SuperArray公司的寡核苷酸基因芯片（Cat.Human OHS-802）检测并分析各基因信号表达,进而探讨重楼皂甙Ⅰ的作用机理。
6、荧光定量RT—PCR方法（相对定量）对选择的芯片结果中差异表达的5个感兴趣的基因进一步验证。
7、RT—PCR检测P53和GADD45α、GADD45γ、GADD45β基因表达水平。
8、Western blot法检测2.5μg/ml的PPⅠ作用于A549细胞AKT磷酸化水平变化。
9、统计分析:数据均采用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果以（?）±s表示,组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）或两样本率比较U检验,P＜0.05为差异具有显著性意义。
三、结果
1、重楼皂甙Ⅰ在体外对NSCLC细胞生长的抑制作用
MTT方法检测发现不同浓度（0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml）的PPⅠ作用于A549、NCI-H460、SK-MES-1细胞24、48及72h表现出抑制效应。2.5μg/ml PPⅠ在三个细胞株中作用24、48、72h均引起明显的抑制,各时点A549的抑制率分别为51.9±7.1%、76.9±2.8%、84.7±4.8%,NCI-H460的抑制率为60.3±10.6%、49.1±7.5%、52.1±2.2%,SK-MES-1的抑制率为67.8±8.9%、60.2±2.7%、71.9±2.9%。10μg/ml PPⅠ对三种细胞的抑制率达到90%作用。A549、NCI-H460、SK-MES-1细胞半数抑制浓度IC50（48h）分别为1.24、2.40、2.33μg/ml。
2、重楼皂甙Ⅰ在体外诱导NSCLC细胞的凋亡
2.5μg/ml PPⅠ处理三种NSCLC细胞（A549、NCI-H460、SK-MES-1）48 h后,DNA ladder明显可见特征性的50-300kb长的DNA大片段形成的“梯状DNA条带”,而对照组未见“梯状DNA条带”。2.5μg/ml PPⅠ作用三种细胞系24h后,Western blot结果显示bcl-2的表达均较对照组明显下调,procaspase-3在PPⅠ组的含量也比对照组减少。
流式细胞术:细胞周期分析显示经2.5μg/ml PPⅠ诱导A549细胞不同时间后发现,G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例均显著下降,而亚二倍体峰（凋亡细胞峰）随着作用时间延长而增加,具有时间依赖性。Annexin V-FITC法检测表明2.5μg/ml PPⅠ作用A549细胞24h的凋亡细胞比例为39.68%,明显高于正常对照。
3、重楼皂甙Ⅰ在体内抑制A549细胞移植瘤生长
重楼皂甙Ⅰ、DDP组与对照组PBS相比,均显著减少肿瘤体积和总量,且重楼皂甙Ⅰ组比DDP组作用明显,抑瘤率为PPⅠ组＞DDP组＞PBS组（P＜0.05）,各组在治疗期间无裸鼠死亡,体重变化无显著差异,显示良好的耐受性。
4、SuperArray Human OHS-802基因芯片分析,2.5μg/ml PPⅠ处理A549细胞后6h、12h上调两倍以上的基因分别有104、34个,下调两倍以上的基因分别有有5、72个,有多个基因与凋亡有关,但BCl-2和BAX在6h和12h时变化不明显。有些基因可能与重楼皂甙Ⅰ抗肿瘤通路有关。
5、qRT—PCR验证基因芯片结果,验证了5个肿瘤信号通路的基因（PIK3CB、PIK3CG、PTEN、JUN、PCTK3）,两种方法所得基因表达倍数大致相当。
6、RT—PCR检测PPⅠ诱导A549细胞P53、GADD45基因表达改变:经2.5μg/mlPPⅠ诱导A549细胞6h后GADD45α表达水平明显高于空白对照组,12h后略有回落,但仍高于空白组水平,GADD45β、GADD45γ表达水平无改变。P53基因在6h后明显表达上调。
7、Western blot检测AKT磷酸化结果显示:2.5μg/ml PPⅠ作用A549细胞后0h、6h、12h、24h各时点的总AKT没有改变,而磷酸化AKT表达明显降低,提示PPⅠ抑制A549细胞AKT磷酸化。
四、结论
1、重楼皂甙Ⅰ在体、内外有不同程度的抗非小细胞肺癌的作用。
2、重楼皂甙Ⅰ在体外对非小细胞肺癌细胞有显著的诱导凋亡作用。
3、重楼皂甙Ⅰ诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡可能是通过多种肿瘤信号转导通路相关的基因实现的,这些基因表达水平的综合作用决定肿瘤细胞的凋亡与否。
4、重楼皂甙Ⅰ可能通过P53/GADD45/JUN信号通路诱导A549细胞凋亡,而且是通过GADD45α途径。
5、重楼皂甙Ⅰ可以抑制AKT蛋白的磷酸化水平从而诱导A549细胞凋亡。
