严重损伤后高迁移率族蛋白B1的改变及其与多器官损害的关系

目的:高迁移率族蛋白B1（HMGB1）作为一种晚期炎症介质,介导了脓毒症和其他系统性炎症的致死性效应。本试验拟应用重度烫伤延迟复苏动物模型,明确HMGB1在严重烫伤中的表达变化规律,进而阐明HMGB1对多器官损害的影响并对其机制进行初步探讨。观察丙酮酸乙酯（EP）与中药血必净治疗对重度烫伤延迟复苏动物HMGB1表达影响及脏器损害的保护作用。旨在为严重损伤后机体脓毒症及多器官功能障碍综合征的预防和治疗提供新思路。 方法:采用30%TBSAШ度烫伤后延迟6小时（h）复苏大鼠模型。雄性Wistar大鼠114只,随机分为:①正常对照组（n=6）,麻醉后活杀;②假烫伤组（n=18）,在假烫伤后6 h腹腔内注入生理盐水（40 ml/kg）,8、24、72 h活杀,无菌取血及组织标本,各时间点均为6只动物;③烫伤组（n=30）,在烫伤后2、12、24、36、48、60 h分别给予3ml/次林格氏液腹腔内注射腹腔内注射,在相应时间点活杀;④EP液（3.23mg/ml）治疗组（n=30）,于烫伤后2、12、24、36、48、60 h分别给予3ml/次EP液腹腔内注射治疗,在相应时间点活杀。⑤血必净治疗组（n=30）,在烫伤后2、12、24、36、48、60 h分别给予血必净注射液（4ml/kg）静脉注射治疗,在相应时间点活杀。无菌留取血及组织标本。后3组分别在烫伤后6 h腹腔内注入生理盐水（40 ml/kg）抗休克治疗,活杀点分别为8、24、72h,每个时间点10只动物。另设实验组研究EP与中药血必净治疗对烫伤大鼠生存时间的影响,观察不同时间点给药后各组动物7天的死亡率。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测组织HMGB1与TNF-α的基因表达;蛋白免疫印记法（Western blot）及免疫组化法（Immunohistochemistry）检测组织HMGB1蛋白的含量;酶联免疫吸附试验（ELISA）分析组织TNF-α蛋白含量;全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、BUN和Cr含量;肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性采用酶学分光光度法测定;小肠组织二胺氧化酶（DAO）活性采用分光光度法测定;采用HE染色观察组织病理学变化。 结果: 1.正常大鼠肝、肺、肾组织均可表达一定量HMGB1 mRNA,烫伤延迟复苏后8h肝、肺、肾组织HMGB1 mRNA表达显著增高,伤后24h各组织HMGB1 mRNA表达达峰值,并可持续至伤后72h。肝组织与肺组织的HMGB1蛋白水平变化与HMGB1 mRNA表达情况基本一致;肾组织HMGB1蛋白仅在烫伤延迟复苏后24h表达显著增加。EP治疗可显著降低8h、24h及72h肝、肺、肾组织的HMGB1 mRNA/蛋白表达。中药血必净治疗亦可显著降低24h及72h的肝、肺、肾组织的HMGB1 mRNA表达。血必净治疗可有效降低24h及72h的肝、肺组织的HMGB1蛋白的表达,亦明显降低了24h肾组织的HMGB1蛋白的含量。 2.烫伤延迟复苏后8h,组织TNF-αmRNA/蛋白表达迅速升高,24小时基本恢复至伤前范围;肝、肺组织TNF-αmRNA/蛋白水平于伤后72小时不同程度再度升高,肝、肺组织TNF-αmRNA/蛋白表达于8h和72h呈双峰样增高;肾组织TNF-αmRNA/蛋白水平于8h和24h显著升高。EP治疗可不同程度地抑制烫伤延迟复苏后肝、肺组织8h及72h的TNF-αmRNA/蛋白表达,亦明显降低肾组织伤后8h和24h的TNF-αmRNA/蛋白上调。血必净治疗抑制了烫伤延迟复苏后72h肝组织TNF-αmRNA表达,显著降低肝组织伤后8h及72h的TNF-α蛋白含量。同时,肺组织8h和72h的TNF-αmRNA表达显著降低,72h肺组织的TNF-α蛋白表达亦明显受到抑制;此外,对肾组织TNF-αmRNA/蛋白表达的下调作用仅在烫伤延迟复苏后24h。 3.烫伤延迟复苏大鼠血清ALT、AST和BUN、Cr水平均呈现不同程度地升高;其中血清ALT、AST和Cr在24h达峰值,血清AST值可持续升高至72h,血清Cr虽然升高较晚,但是可持续时间较长,72h仍显著升高。肺组织MPO活性于烫伤延迟复苏后8h显著升高,24h达高峰,72h下降至接近正常水平。肠组织DAO活性在烫伤延迟复苏后8h24h持续降低。EP治疗可显著降低烫伤延迟复苏大鼠血清ALT、AST在各个时间点的水平,可明显降低24h血清Cr及8h、24h血清BUN的含量。血必净治疗可有效降低延迟复苏大鼠血清ALT、AST在各个时间点的水平（除伤后8h血清AST）,能明显降低24h、72h血清Cr含量及24h BUN的含量。EP治疗能显著降低烫伤延迟复苏大鼠术后8h、24h肺组织MPO活性;亦能明显升高伤后8h24h小肠DAO活性。此外,血必净治疗可以显著降低烫伤延迟复苏大鼠术后24h肺组织MPO活性,并升高伤后8h24h小肠组织DAO活性。 4.烫伤延迟复苏大鼠肝、肺、肾组织在各个时间点均表现炎细胞侵润,形态结构破坏明显。EP与血必净治疗对于烫伤延迟复苏大鼠的肝、肺、肾组织炎症病变均有改善,其病理损伤程度明显减轻。 5.EP和血必净注射液治疗均可显著降低严重烫伤延迟复苏大鼠的死亡率。与烫伤组相比,EP治疗组动物的总死亡率显著降低（P<0.01）。与烫伤组相比,血必净治疗组动物的总死亡率亦显著降低（P<0.05）。 结论:1.烫伤延迟复苏可以促进HMGB1基因表达与合成释放,其动力学变化规律表现为HMGB1产生较晚、下降缓慢的“晚期炎症介质”特点。HMGB1在诱导严重烫伤动物过度的炎症反应与多器官功能损害中具有重要作用。 2.组织TNF-α表达上调可能有介导产生HMGB1的效应;在烫伤延迟复苏时机体晚期炎症介质HMGB1对TNF-α的产生具有显著影响,二者可能存在着相互诱生、相互促进的关系。 3. EP或血必净均有效下调TNF-α、HMGB1等炎症介质的过量表达,从而抑制机体的过度炎症反应和减轻多器官损害,改善动物预后,提高严重烫伤动物存活率。对于严重烧烫伤后脓毒并发症的防治具有潜在应用价值。