PI3K抑制剂LY294002诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡机制的研究

目的：P13K可以促进细胞的生长、增殖、分裂和迁移,其异常高表达是卵巢癌进展中的重要事件。我们在前次实验中观察到,P13K抑制剂LY294002可以引起卵巢癌SKOV-3细胞凋亡增加；同时发现Akt及下游凋亡抑制蛋白(XIAP和cIAP2)的表达也出现下调,这提示LY294002的促凋亡效应可能与Akt的活性被抑制有关,但其引起凋亡启动的具体机制尚不清楚。本实验使用Annexin V-FITC/PI双染色法和荧光底物法,分别检测LY294002作用SKOV-3时的凋亡率变化及凋亡蛋白酶活性,探讨P13K-Akt信号通路促进凋亡的作用机制,为PI3K小分子抑制剂应用于卵巢癌临床治疗提供理论依据。 方法：本实验以人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV-3为研究对象,首先在37℃、5%CO2条件下培养卵巢癌细胞,选择其中汇合度达到70%左右,且生长良好的细胞进行以下实验。(1)使用Annexin V-FITC/PI双染色法通过流式细胞仪检测LY294002以不同浓度(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)作用不同时间(24h、48h、72h、96h)后细胞的凋亡率。(2)将正常贴壁生长的SKOV-3细胞随机分为对照组和药物组,药物组加入适量LY294002使其终浓度达到40μM；于48h使用荧光底物法通过荧光分光光度计分别检测对照组和药物组细胞中Caspase-3, Caspase-9, Caspase-8的活性。(3)所得数据以x±s表示,多组间均数比较采用方差分析,两组间均数比较采用配对样本t检验,p<0.05有统计学意义,统计运算使用SPSS17.0。 结果：(1)不同浓度LY294002(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)作用不同时间(24h、48h、12h、96h)后的细胞凋亡率(%)：24小时,1.54、2.20、2.48、3.37、5.13；48小时,2.35、6.51、7.28、9.62、10.49；72小时,2.98,6.78,7.73,9.22,12.14；96小时,3.64,7.23,8.21,11.57,15.43。相同浓度LY294002各时间组间比较,凋亡率随时间延长而增加,差异有统计学意义(p<0.05)；但相同孵育时间各浓度组间比较,凋亡率表现不一致,当以低浓度(5μM、10μM)LY294002孵育24小时,凋亡率无明显改变,差异无统计学意义(p>0.05)；当孵育时间超过24小时(48h、72h、96h),细胞凋亡率随浓度的提高而增加,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)LY294002(40μM,48h)作用后caspase-3活性：对照组为245.22,药物组为484.78,药物组荧光强度值高于对照组(p<0.05),即LY294002作用下SKOV-3细胞中caspase-3的活性高于对照组。(3)LY294002(40μM,48h)作用后caspase-9活性：对照组为190.25,药物组为255.50,药物组荧光强度值高于对照组(p<0.05),即LY294002作用下SKOV-3细胞中caspase-9的活性高于对照组。(4)LY294002(40gM,48h)作用后caspase-8活性：对照组为99.71,药物组为98.71,药物组荧光强度值与对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05),即LY294002作用下SKOV-3细胞中caspase-8的活性与对照组相比无差别。 结论：LY294002引起的卵巢癌SKOV-3细胞凋亡增加,可能是其间接启动凋亡线粒体途径后引起caspase-9与caspase-3活性升高所致。