鹿茸归经靶向调控骨关节炎TGF-β/Smads信号通路机制研究

目的： “归经”理论是中医药学理论体系中的重要组成部分,也是我们认识疾病和临证运药的基础,在“归经”理论的指导下,目前治疗骨关节炎多运用归肝、肾经的药物组方,为了进一步研究“归经”的本质,及“归经”理论与现代生物分子信号通路的相关性,选取归肝、肾经的代表中药“鹿茸”,对其“归经”本质进行相关研究,并探讨该药调控骨关节炎软骨中TGF-β/Smads信号通路的机制。 方法： 1文献研究 借助“电子版《中华医典》数据库”,分别以骨痹、膝痛、膝痹、痛痹、鹤膝风、关节疼痛、屈伸不利等为关键词检索,并用Excel表格建立数据库,用SPSS18.0软件进行统计,通过对方剂中药物的功效和归经进行频数分析,从而分析不同种类药物的运用情况,同时,采用系统聚类分析对药物进行样本聚类统计,并运用中医药理论对结果进行分析。 2归经研究 采用Hulth方法建立大鼠骨关节炎模型,随机分为鹿茸组、模型组和正常组,采用鹿茸水溶液进行灌胃,基于环核苷酸观测和受体观测理论,采用ELISA法检测不同组软骨中cAMP、cGMP含量,荧光定量PCR和蛋白免疫印迹杂交方法检测大鼠软骨TGF-βI型、TGF-βII型受体基因和蛋白的表达。 3软骨组织总RNA提取研究 选取3月龄SD大鼠9只,采用Rneasy Lipid Tissue Kit、RNAout试剂盒和经典Trizol三种方法对大鼠软骨组织进行总RNA提取,通过RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,并进行普通PCR扩增,以研究软骨总RNA最佳提取方案。4鹿茸靶向调控TGF-β/Smads信号通路的研究 选取3月龄SPF级健康雌性SD大鼠100只,按体重分层随机选取20只作为正常组,余者行Hulth方法造模,病理组织切片验证造模成功后,按体重分层随机数字表法分成4组：鹿茸低剂量组、鹿茸高剂量组、盐水组、模型组,于灌胃后2周、4周、6周,分别取各组大鼠膝关节软骨,采用免疫组织化学法检测软骨II型胶原的表达,荧光定量PCR和蛋白免疫印迹杂交方法分别检钡TGF-β1、Smad2、 Smad3、 Smad4基因和蛋白的表达。 结果： 1药物功效使用频率分析结果显示,补虚药、解表药、活血化瘀药、祛风湿药、温里药和祛湿药的总使用频率达到79.2%,是构成治疗骨痹的常用药物；归经药物使用频率分析结果显示,入肾经的药物最多,频率为21.4%,其次是归肝经和脾经的药物分别占17.9%；根据高频数使用药物的样本聚类分析结果,并结合其功效,可以将这些药物聚为6类,多以滋补肝肾、活血通络、温里散寒等为法进行药物组合。 2ELISA法检测软骨组织中cAMP、cGMP结果显示,鹿茸组cAMP和cGMP值均高于模型组,模型组cAMP和cGMP值低于正常组,三组cAMP (F=10351.408, P=0.000)、cGMP (F=63032.016,P=0.000)、cAMP/cGMP (F=6530.879,P=O.000)之间比较均有显著性差异(P<0.01)；荧光定量-PCR和蛋白免疫印迹杂交方法检测各组大鼠软骨TGF-βI型、TGF-βII型受体表达结果显示,鹿茸低剂量、高剂量组在灌胃后随时间的延长,TGF-β RImRNA, TGF-β RIImRNA和蛋白的表达量逐步增加,经重复测量方差分析,三个时间段间总体差异有显著性意义(F=161.672,P=0.000)。 3Rneasy Lipid Tissue Kit法获得的总RNA纯度高、完整性和稳定性好,能成功逆转录合成双链cDNA,普通PCR扩增能够得到我们所需要的基因产物,而RNAout试剂盒和经典Trizol法获得的总RNA纯度低,不能满足后续PCR实验需要。 4软骨组织病理学观察显示,模型组2周时,光镜下可见表层软骨细胞肿胀变圆,扁平的软骨细胞减少,软骨细胞簇集,4周时,表层及中层细胞收缩,细胞数量弥漫性增多,出现大量簇集细胞团,6周后,大部分软骨的表层细胞消失,软骨表面出现溃烂缺损,软骨细胞数量减少,可见坏死崩解细胞,潮线紊乱甚至消失；灌胃6周后,软骨切片Mankin's评分结果显示,鹿茸高剂量、低剂量组Mankin's得分小于模型组和盐水组,单因素方差分析显示,组间比较差异显著,有统计学意义(F=87.840,P=0.000)；免疫组织化学检测软骨II型胶原蛋白表达,可见鹿茸低剂量和高剂量组的软骨层有广泛的棕褐色细胞,数量明显高于盐水组和模型组；荧光定量PCR和蛋白免疫印迹杂交方法分别检测TGF-β1、Smad2、 Smad3、Smad4表达结果显示,TGF-β1mRNA和蛋白表达量随灌胃时间延长逐步增加,且表达量均高于其它组,经重复测量方差分析,三个时间段间总体差异有显著性意义(F=408.841, P=0.000), Smad2、Smad3mRNA和蛋白检测可见,鹿茸低剂量、高剂量组在灌胃后2、4周时,关节软骨组织中的Smad2.Smad3mRNA和蛋白的表达增高,6周时,其表达量没有继续增高反而降低,但与其他组比较,经重复测量方差分析,三个时间段间总体差异有显著性意义(F=240.511,P=0.000, F=1325.174, P=0.000), Smad4mRNA和蛋白的表达随灌胃时间的延长逐步增加,经重复测量方差分析,三个时间段间总体差异有显著性意义(F=197.035,P=0.000)。 结论： 1古人在临证运药治疗“骨痹”时,始终以肝肾亏虚为“骨痹”的发病根本原则为指导,多选用归肝、肾、脾经的药物,以滋阴补肾、活血化瘀、温里除湿、补虚活络等为法进行药物组合,在治疗“肝肾亏虚”之本时,兼以活血、温里、通络、祛湿以治其标。 2实验结果证实鹿茸能够影响软骨内环核苷酸的变化,而且鹿茸能够上调软骨细胞膜上TGF-βRI、TGF-RII受体的表达,由此推断软骨可能是鹿茸归经选择性作用的靶组织之一,并且软骨细胞膜上的TGF-β I型、TGF-βII受体可能是鹿茸归经选择性作用于软骨的靶点之一。 3基于软骨组织的特异性,Trizol法不适合用于大鼠关节软骨组织总RNA的提取,而采用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit法提取的软骨总RNA纯度较高,能够保证后续实验的实施。 4鹿茸能够调控软骨组织中TGF-β1Smad2、 Smad3、 Smad4基因和蛋白的表达,而且软骨病理切片Mankin's评分和软骨II型胶原表达检测提示,鹿茸能够促进软骨细胞增殖、分化,延缓软骨的退变,由此推论,鹿茸提高了TGF-β/Smads信号通路中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4分子的表达,从而促进该信号通路的转导,起到促进软骨形成的作用,而且,软骨细胞内的Smad2、Smad3、 Smad4基因和蛋白的变化可能是骨性关节炎发病的重要机制之一。