利用果蝇模型研究帕金森病相关基因α-synuclein，PINK1和LRRK2的作用机制

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的老年性进行性神经系统变性疾病，在60岁以上人群中的发病率为1-2％。临床症状为静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓、平衡失调或震颤等，在病理学上主要表现为黑质致密部的多巴胺能神经元损失和Lewy小体聚集物的形成，到目前为止没有很好的治疗方法，只能针对性的用药如左旋多巴等来缓解症状。 PD患者以散发病例为主，5-15％患者有家族史。通过对少数家族遗传性患者进行研究，已发现了至少6个基因的突变与PD相关，包括常染色体显性遗传的α-synuclein，UCHL1和LRRK2基因以及常染色体隐性遗传的Parkin，PINK1和DJ-1基因。进一步研究表明α-synuclein是Lewy小体的主要成分，突变体可以加剧其聚积；Parkin为E3连接酶，介导了蛋白泛素化和多种蛋白的降解，糖基化的α-synuclein和其互作蛋白synphilin-1均为其底物；PINK1具有激酶活性，定位于线粒体，与其功能密切相关；LRRK2也具有激酶活性，体外试验证明突变体的激酶活性升高在神经元变性中起着重要作用，可以调节小鼠原代神经元细胞轴突的生长和形态。这些基因的功能、相互作用以及与疾病相关的突变如何导致相应的病理改变还不非常清楚，因此开展这些基因的功能研究对深入了解PD的分子发病机制有至关重要的作用。 果蝇已成为研究人类遗传性疾病特别是神经系统变性疾病的一种重要模式生物。在上述六个PD相关基因中果蝇有五个同源基因包括UCHL1(Uch／CG4265)，LRRK2(CG5483)，Parkin(parkin／CG10523)，PINK1(Pink1／CG4523)和DJ-1(DJ-1a／CG6646，DJ-1b／CG1349)，已有研究证明这些基因在功能上与人类同源基因非常相似。 本研究将利用果蝇模型来重点研究PD相关基因α-synuclein和PINK1在果蝇体内的相互作用，敲除LRRK2的果蝇在神经元等方面的改变，从而加深对PD发病机制的了解。 利用UAS-α-synuclein(WT，A30P，A53T)和UAS-hPINK1独立的果蝇模型，构建了同时可以表达两个基因的重组果蝇品系UAS-hPINK1；UAS-α-synuclein(WT，A30P，A53T)。这些品系与GAL4系统杂交，在果蝇体内单独表达和共表达这两个基因，用不同的药物来处理果蝇，观察这两个基因对果蝇存活率的影响，发现共表达PINK1和α-synuclein两个基因组比单独表达α-synuclein组的存活率升高；用免疫荧光染色来检测不同时间和药物处理后的果蝇神经元的改变，发现共表达PINK1和α-synuclein两个基因组的多巴胺能神经元数目比单独表达α-synuclein组明显增加。这些实验结果证实了PINK1的抗氧化应激能力，可以保护α-synuclein引起的神经元损伤。 利用LRRK2 Knockout果蝇模型进行研究，用RT-PCR对其进行鉴定，发现LRRK2 Knockout后失去了激酶活性。观察果蝇基本生命特征，发现LRRK2 Knockout果蝇均可育和存活，寿命与野生型相近；用不同的药物处理果蝇后发现LRRK2 Knockout果蝇对氧化应激反应与野生型相似；分别用NB33抗体和TH抗体对腹外侧小神经元和多巴胺能神经元进行免疫荧光染色，发现LRRK2 Knockout果蝇的多巴胺能神经元数目和分布未见明显改变，而腹外侧小神经元的轴突出现明显的异常，包括形态、长度和分支均发生了异常的改变。这些结果提示LRRK2激酶活性并不影响多巴胺能神经元的存活和对氧化应激的反应，但LRRK2调节着神经元轴突的形态和生长。 这些研究结果将助于阐明PD的致病机理，进行药物筛选和开发新的预防治疗PD的药物。