丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎,是我国传统医药中普遍应用的药物之一,始载于《神农本草经》,是常用的活血化瘀中药。根据花色的不同,丹参分为白花丹参和紫花丹参。丹参酮是其主要化学成分,研究表明丹参酮类化合物具有良好的抗炎功能。本文将首先对白花丹参和紫花丹参中丹参酮类成分进行研究,发现两种花色丹参中丹参酮类成分的差异,然后对白花丹参中丹参酮类化合物进行分离提取及结构鉴定,最后进行丹参酮IIA、丹参酮I和甲基丹参酮的抗炎活性机理研究。为研究白花丹参和紫花丹参中丹参酮类成分和含量的差异,采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定,色谱柱为Agilent XDB-C18柱(4.6mm×250 mm,5μm),以甲醇和水(含体积比0.1%甲酸)为流动相,梯度洗脱,选取十个丹参酮类化合物为对照品,在280nm处测定白花丹参、山东紫花丹参和四川紫花丹参中各丹参酮类成分的含量。结果表明,丹参酮I IA在2.00-100.00μg(Y=40.601X+159.68,r=0.9979)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为0.46%;丹参酮I在2.00-100.00μg(Y=22.335X+72.957,r=0.9975)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为1.76%;柳杉酚在2.00-100.00μg(Y=30.296X+98.144,r=0.9984)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为2.28%;弥罗松酚在2.00-100.00μg(Y=6.7841X+27.737,r=0.9982)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为1.37%;隐丹参酮在2.00-100.00μg(Y=19.936X+72.423,r=0.9981)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为2.09%;丹参新醌B在2.00-100.00μg(Y=41.554X+161.46,r=0.9978)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为1.27%;丹参新醇在2.00-100.00μg(Y=23.688X+64.779,r=0.9984)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为1.98%;鼠尾草酚酮在2.00-100.00μg(Y=79.323X-66.428,r=0.9999)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为1.93%;二氢丹参酮I在2.00-100.00μg(Y=52.933X+194.45,r=0.9980)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为1.86%;甲基丹参酮在2.00-100.00μg(Y=27.794X+0.392,r=0.9999)范围内呈良好线性关系,平均加样回收率RSD为1.72%。此方法简便、准确、重现性好。结果表明不同种类丹参中丹参酮类成分含量差异较大,从白花丹参中检测到柳杉酚、丹参新醌B和丹参新醇三种丹参酮类成分,而在紫花丹参中没有检测到这三种成分。为提取分离到丹参酮类化合物,采用二氯甲烷和甲醇浸提,硅胶柱层析法和凝胶柱层析法分离纯化。以环己烷:二氯甲烷(10:1)混合溶剂溶解丹参酮提取物,湿法上样,洗脱流速为1BV/h,用不同比例的环己烷-二氯甲烷梯度洗脱,洗脱5-6个柱体积。分别得到环己烷-二氯甲烷(1 0:1)部位,环己烷-二氯甲烷(1:2)部位和纯二氯甲烷部位。以二氯甲烷-甲醇不同梯度洗脱环己烷-二氯甲烷(1:2)部位,得到7个部位(部位Fr A—Fr G)和四个化合物。其中Fr E部位用不同比例的环己烷-二氯甲烷梯度洗脱分离得到两个化合物;Fr F部位用不同比例的环己烷-二氯甲烷梯度洗脱和HPLC半制备分离得到两个化合物;Fr G部位用不同比例的环己烷-二氯甲烷梯度洗脱分离得到两个化合物。对分离得到的10种丹参酮类化合物进行1HNMR、13CNMR等波谱数据分析,并结合文献和数据库比对,最终确定这10种化合物的化学结构,并使用LC-MS/MS初步确定了一种新化合物的结构。通过完全弗氏佐剂致敏小鼠,获得类风湿性关节炎模型,以研究丹参酮I IA、丹参酮I和甲基丹参酮的抗炎作用。结果表明造模后各组小鼠之间的足爪肿胀程度相比空白组差异显著,给药后,阳性药组、丹参酮I IA组,丹参酮I组,甲基丹参酮组的小鼠足趾肿胀程度与模型组相比明显减轻;模型组小鼠血清中的I FN-γ水平明显低于空白组,给药后各组小鼠血清中的IFN-γ水平较模型组升高(P<0.05),模型组小鼠血清中的IL-4、LTB4、NO水平明显高于空白组,给药后各组小鼠血清中的IL-4、LTB4、NO水平较模型组降低(P<0.05);模型组中的小鼠发现跺关节滑膜组织中出现较多炎性细胞浸润现象。治疗后,该现象明显减轻,软骨破坏程度有所改善。本课题通过硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化得到11种丹参酮类化合物,对其进行1HNMR、13CNMR等波谱数据分析,确定了10种化合物的结构,使用LC-MS/MS初步确定了一种新化合物的结构,并对其中三种丹参酮类成分做了抗炎活性的考察,为进一步的研究提供科学依据。
