丹参乙酸镁对高糖诱导的细胞内氧化损伤的保护作用及其机制研究

背景：糖尿病患者高血糖诱导的氧化应激与糖尿病及其包括动脉粥样硬化等一些并发症的发生发展密切相关。尽管目前有多种抗氧化剂应用于防治糖尿病及其并发症,但相当一部分抗氧化药物不具有调节氧化应激和增加机体抗氧化防御系统的作用。在临床上用于防治多种疾病的中药丹参的单体丹酚酸B,通常以其镁盐丹参乙酸镁(magnesium lithospermate B,LAB)的形式存在,具有很强的抗氧化性,研究发现LAB可以通过多种机制抑制高血糖引起的血管损害,从而减缓高血糖诱发的动脉粥样硬化进程。 目的：本实验以人胚肾细胞(HEK293T)细胞为研究对象,进一步证实LAB对氧化应激下细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生的影响；同时以血红素加氧酶(heme oxygenase, HO-1)为靶点,观察LAB对高糖诱导下HO-1表达的调控,并进一步研究LAB调控HO-1的分子机制。 方法： 1.ROS检测：收集处理好的细胞,向细胞内加入终浓度为10μmol/L DCFH-DA探针共孵育30 min, DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内被ROS氧化生成有荧光的DCF。装载并洗涤未装载DCFH-DA探针后,在激发波长488nm、发射波长525nm条件下,流式细胞仪检测各组细胞内ROS荧光强度。 2.运用QRT-PCR以及Western blotting检测高糖及LAB干预对HEK293T细胞内HO-1基因mRNA和蛋白表达的影响。 3.检测LAB对核转录因子E2p45相关因子2 (nuclear factor E2-related factor2, Nrf2)的核移作用。分别用高糖及不同浓度的LAB干预HEK293T细胞,用细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒,抽提核内总蛋白质,运用Western blotting检测其对细胞核内Nrf2蛋白表达的影响。 4.采用PCR、转化、测序等技术构建pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表达载体,并将Non-specific control shRNA阴性对照载体、pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表达载体分别瞬时转染入HEK293T细胞,转染48h后,用高糖及50μmol/L LAB干预HEK293T细胞,Western blotting检测细胞内Nrf2及HO-1的蛋白表达水平。 结果： 1.与对照组(30.72±0.47%)相比,30 mmol/L高糖组(79.00±5.8%)以及100μmol/L H2O2组(92.83±8.9%)细胞内ROS的产量明显增高,且差异具有统计学意义(P<0.05)；与30 mmol/L高糖组(79.00±5.8%)相比,LAB预处理组(27.41±4.13%)细胞内ROS的产量有回落的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)；与100μmol/LH2O2组(92.83±8.9%)相较；LAB干预组(43.66±5.27%)细胞内ROS的产量也有回落的趋势,差异同样具有统计学意义(P<0.01)。 2.HEK293T细胞给予高糖刺激后,HO-1 mRNA表达上调,于24h达到高峰,48h有所下降,高糖作用2h,6h,24h,48h和对照组比较,HO-1mRNA相对表达量分别为3.96±0.71,9.57±1.39,12.29±2.54,7.80±0.40,(P值分别为0.022,0.003,0.000)。蛋白变化趋势与HO-1 mRNA相同,高糖作用第2h,6h,24h和48h,对照组的HO-1与β-actin蛋白表达量的比值分别为0.087±0.01,0.326±0.092,0.718±0.206,0.889±0.128,0.274±0.036,其中高糖培养6h和24h明显增加HO-1蛋白表达(P<0.01)。HEK293T细胞预先30min给予不同浓度的LAB干预后,HO-1 mRNA均有不同程度的增加,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L剂量的LAB干预组HO-1 mRNA相对表达量分别为1.37±0.32,1.69±0.31,2.19±0.26,相较于高糖对照组,差异具有统计学意义(P<0.045,P<0.015,P<0.000)。HO-1蛋白变化趋势与mRNA相同,高糖对照组与10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L剂量的LAB干预组HO-1与β-actin蛋白表达量的比值分别为0.853±0.107,0.977±0.061,1.156±0.0182,1.470±0.138。10μmol/L丹参乙酸镁干预组HO-1蛋白水平与高糖组比较没有显著性差异,在50μmol/L和100μmol/L时,LAB干预组较高糖对照组显著增加(P值分别为0.021,0.001)。 3.HEK293T细胞给予高糖刺激24h后,转录因子Nrf2转位于细胞核内量增加(P<0.05),相对于高糖对照组,50μmol/L,100μmol/L LAB干预组转位细胞核内Nrf2量进一步增高,差异具有统计学意义(P=0.015,P=0.000)。 4.Nrf2沉默后,LAB进一步诱导高糖刺激下HO-1蛋白表达的作用消失。 结论：LAB不但可以直接清除氧化应激下细胞内过多的ROS,而且还可以通过激活细胞内重要转录因子Nrf2及其下游基因HO-1抗氧化酶；将Nrf2沉默后,LAB进一步诱导高糖刺激下HO-1蛋白表达的作用消失,这种作用部分是通过Nrf2信号通路的激活来实现的。