二咖啡酰奎宁酸通过PI3K/Akt/HIF-1α信号通路减轻氧化应激所导致的H9c2心肌细胞损伤

研究背景心力衰竭(heart failure,HF)是我国常见病及高发病,严重影响居民的健康、社会与经济发展。HF是多种原因导致的心脏结构和/或功能异常,引起心室收缩和或/舒张障碍,所引发的一组复杂临床综合征。HF主要表现为呼吸困难、疲乏和体液潴留等。多数患者就诊时已发展为慢性心力衰竭,而针对HF的治疗主要为改善其临床症状,但是患者对药物治疗的依存性差,远远不能达到预期效果。从目前来看,尽管各种新型药物研究成果不断公布,但除了血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(angiotensin receptor/neprilysin inhibitor,ARNI)、血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotonin receptor blocker,ARB)、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂、钠-葡萄糖协同转运体(sodiumglucose cotransporter-2,SGLT2)抑制剂及利尿剂这几类药物外,至今尚无突破性进展。心肌细胞凋亡在HF的病因和发病机制中起着关键作用,在心肌梗死、动脉粥样硬化和缺血再灌注时会出现明显的心肌细胞凋亡,其中氧化应激是诱导心肌细胞凋亡的主要因素之一。经典信号通路磷脂酰肌醇-3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路的激活是心肌细胞保护的重要机制之一,能通过激活下游靶目标,促进心肌细胞的存活。PI3K/Akt信号通路的下游信号中,缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在缺氧微环境中可通过调控数百种靶基因而维持细胞的存活,是近年来的研究热点。二咖啡酰奎宁酸(dicaffeoylquinic acids,DCQAs)是一种重要的膳食多酚,具有多酚羟基化学结构以及显著的抗氧化、清除自由基、抗病毒等广泛的生物学活性,但其作用机制尚不完全清楚。目的本研究通过叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)诱导H9c2心肌细胞构建体外氧化应激模型,模拟H9c2细胞凋亡过程;从天然的6种DCQAs中筛选出抗H9c2细胞凋亡最强的一种,并探讨活性DCQA是否通过调控PI3K/Akt/HIF-1α信号通路对H9c2细胞起保护作用,为DCQAs防治HF提供科学依据。方法1天然DCQAs处理增加了TBHP诱导后的H9c2细胞活力通过TBHP诱导H9c2细胞建立氧化应激模型,模拟H9c2细胞凋亡过程。利用CCK-8法评估6种天然DCQAs抗氧化应激活性,筛选出抗氧化应激活性最强的一种;并对其进行给药范围筛选。2天然3,4-DCQA抗HF的生物信息学分析中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)及Swiss Target Prediction中药信息数据库筛选DCQAs相关靶点;Dis Ge NET及Gene Cards数据库筛选潜在HF治疗靶点;STRING数据库的蛋白质相互作用网络(protein protein interaction network,PPI)分析,DAVID在线平台分析基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析,采用Cytoscape软件网络可视化,根据拓扑数据得到PPI中的关键靶点;对主要活性成分和关键的潜在治疗靶点进行分子对接分析。3天然3,4-DCQA对TBHP诱导的H9c2细胞中PI3K/Akt/HIF-1ɑ信号通路的影响利用Weatern blot法检测3,4-DCQA对TBHP诱导的H9c2细胞中p-PI3K、p-Akt、Akt、p-Akt/Akt、HIF-1ɑ、p-PTEN、GAPDH、Nrf2、ROS及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平;利用RT-q PCR法检测3,4-DCQA对H9c2细胞中PI3K、Akt及HIF-1ɑ的m RNA的表达水平。4 PI3K/Akt/HIF-1α信号通路抑制下3,4-DCQA对TBHP诱导H9c2细胞的影响加入PI3K抑制剂后,CCK-8法检测3,4-DCQA对TBHP诱导的H9c2细胞活性;Weatern blot法检测H9c2细胞中p-PI3K、p-Akt、Akt、p-Akt/Akt、HIF-1ɑ、p-PTEN、GAPDH及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平;RT-q PCR法检测H9c2细胞中PI3K、Akt、HIF-1ɑ信号通路m RNA表达水平。5天然3,4-DCQA处理以PI3K依赖的方式激活了细胞内PI3K/Akt/HIF-1ɑ信号通路在非氧化应激条件下,单用3,4-DCQA处理H9c2细胞,Weatern blot法检测H9c2细胞中p-PI3K、p-Akt、Akt、p-Akt/Akt、HIF-1ɑ、p-PTEN、GAPDH及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平;RT-q PCR法检测H9c2细胞中PI3K/Akt/HIF-1ɑ信号通路m RNA表达水平。结果1天然DCQAs增加了TBHP诱导后的H9c2细胞活力6种天然DCQAs在低浓度时对H9c2细胞无毒性;用不同浓度的6种DCQAs预处理TBHP诱导的H9c2细胞,发现3,4-DCQA保护H9c2细胞存活能力最强;且3,4-DCQA给药浓度在1-320μM时,对H9c2细胞无毒性,且在20-160μM时抗H9c2细胞凋亡效果最好。2天然3,4-DCQA抗HF的生物信息学分析从数据库中共收集到HF相关靶点13527个以及3,4-DCQA相关生物靶点43个,其中3,4-DCQA治疗HF潜在靶点41个。CASP3、AKR1B1、APP、CA9、FYN这5个蛋白均位于核心位置,主要参与胰岛素信号通路、TNF信号通路和PI3K-Akt信号通路,从而调控细胞凋亡及糖尿病的发生发展。其中凋亡蛋白CASP3(Caspase-3)在细胞凋亡阶段起核心作用。GO富集分析表明,3,4-DCQA治疗HF的生物过程(biological process,BP)主要涉及细胞蛋白代谢过程和心肌肥大等;细胞组分(cellular component,CC)主要涉及细胞质、线粒体和高尔基相关囊泡等;分子功能(molecular function,MF)主要涉及碳酸盐脱氢酶活性、3',5'-环-核苷酸磷酸二酯酶活性等。KEGG通路富集分析表明,3,4-DCQA治疗HF主要涉及氮代谢途径、糖尿病相关并发症中AGE-RAGE信号通路、脂质代谢和动脉粥样硬化等。3天然3,4-DCQA对TBHP诱导的H9c2细胞中PI3K/Akt/HIF-1ɑ信号通路的影响3,4-DCQA能减少TBHP诱导的H9c2细胞凋亡,通过促进PI3K、Akt、HIF-1ɑ的m RNA表达,增加p-PI3K、p-Akt、HIF-1ɑ蛋白表达,p-Akt/Akt比例增加,降低ROS、Nrf2蛋白表达,而对Akt和p-PTEN蛋白无显著影响;同时可以抑制凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达。4 PI3K/Akt/HIF-1α信号通路抑制下3,4-DCQA对TBHP诱导H9c2细胞的影响使用PI3K抑制剂LY294002后,3,4-DCQA仍能促进PI3K、Akt、HIF-1ɑ的蛋白及m RNA表达,增加p-Akt/Akt比例,降低凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达。5天然3,4-DCQA以PI3K依赖的方式激活了细胞内PI3K/Akt/HIF-1ɑ信号通路在非氧化应激状态下,经3,4-DCQA单独处理的H9c2细胞,PI3K、Akt、HIF-1ɑ的m RNA表达增加,p-PI3K及其下游p-Akt、HIF-1ɑ蛋白表达增加,凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加,而各组Akt及p-PTEN蛋白无明显变化。结论本研究利用TBHP诱导H9c2细胞凋亡,模拟HF过程,发现3,4-DCQA可以通过调控PI3K/Akt/HIF-1ɑ信号通路保护由TBHP损伤的H9c2细胞,抑制氧化应激引起的细胞凋亡,可为新药研发和HF的防治提供新的思路。