苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠降糖、调脂作用的机制研究

目的： 中医认为苦瓜有清热、泻火、消渴等作用，而现代医学也证明，苦瓜总皂苷具有抗糖尿病作用，但其作用机制尚不清楚。本研究旨在通过探讨苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠的降血糖作用、对血脂和血浆脂肪因子含量的影响以及调节作用和对胰岛素信号转导通路的作用等方面来揭示苦瓜总皂苷抗2型糖尿病作用的机制。 材料与方法： 论文一：取清洁级雄性SD大鼠60只，随机取8只作为正常对照组，其余用高脂高糖饮食喂养8周后禁食12小时，按照25mg/kgSTZ的量尾静脉注射。72小时后取大鼠的空腹尾尖血，用便携式血糖仪测定血糖值，以空腹血糖≥11.1mmol/L为糖尿病大鼠造模成功的指标。将正常对照组大鼠和合格的糖尿病模型大鼠40只分成6组，每组8只。1组为正常对照组；2组为2型糖尿病模型对照组；3组为二甲双胍组，给予二甲双胍50mg/(kg d)灌胃治疗。4～6组为苦瓜总皂苷组，分别每天一次给予100、200和400mg/(kg d)苦瓜总皂苷灌胃治疗。给药8周末称重，心尖取血，全自动生化分析仪测定血糖，ELISA法测定胰岛素。快速剪取肝脏、胰腺部分组织放入标记好的4%甲醛固定液瓶中，制石蜡切片，用于测定肝糖原的PAS染色和胰岛素的免疫组化实验，剪取一小块胰腺组织放入戊二醛固定液中用于电镜检测观察胰岛β细胞的超微结构，并留取大腿骨骼肌用western blot法检测骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（Glucose transporter4，GLUT-4）表达量。 论文二：将3组中的二甲双胍组换成非诺贝特组，给予非诺贝特100mg/(kg d)灌胃8周，其余的分组、治疗均同第一部分，分别测定大鼠体重，用全自动生化分析仪测定各项血脂指标，HE染色观察脂肪细胞形态，ELISA法检测血浆脂肪细胞分泌因子脂联素、瘦素、抵抗素、TNF-α和IL-6的含量，用Western blot法检测肝脏组织的PPAR-α和脂肪组织的PPAR-γ的蛋白表达。 论文三：动物造模、分组、给药同第一部分，留取部分肝脏组织，分别用RT-PCR方法检测胰岛素信号转导通路中的相关因子Akt-2、PTP-1B、SOCS-3、JNK、PTEN和AMPK的mRNA和蛋白表达量，用Western blot方法检测磷酸化Akt（Ser473）、PTP-1B、SOCS-3、JNK、PTEN和磷酸化AMPK（Thr172）的蛋白表达量。 所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS17.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)，多重比较用least significant difference (LSD)法，P<0.05认为差异具有统计学意义。 结果： 论文一： 1.苦瓜总皂苷组和二甲双胍组大鼠的血糖值与糖尿病模型组大鼠比较均有所降低（P<0.01）。糖尿病模型大鼠空腹胰岛素值较对照组明显增高，给药8周后各组胰岛素值与糖尿病模型组相比均有降低（100mg苦瓜总皂苷组P<0.05，其他各组P<0.01）。随着苦瓜总皂苷剂量的增加，空腹血糖、胰岛素值和稳态胰岛素抵抗评价指数（HOMA-IR）降低更明显（P<0.01）。 2.2型糖尿病模型组胰岛β细胞的数量较正常对照组明显减少，但胰岛素染色阳性的β细胞数量占所有β细胞数量的比例明显增加，而且染色较深。苦瓜总皂苷治疗各组的胰岛素分泌颗粒较2型糖尿病模型组增加（P<0.05或P<0.01）。而苦瓜总皂苷各组的胰岛素染色阳性β细胞数量占总β细胞数量的比例较2型糖尿病模型组却有所减少，并随苦瓜总皂苷的剂量增加有逐渐递减的趋势，400mg组与正常对照组接近。 3.通过电镜检测发现糖尿病模型大鼠胰岛β细胞核固缩，分泌颗粒数量减少。苦瓜总皂苷组和二甲双胍组相似，β细胞分泌颗粒数量较糖尿病模型组增加，但仍少于正常对照组。随苦瓜总皂苷剂量的增加分泌颗粒有增多的趋势。 4.糖尿病模型组大鼠肝脏中紫红色糖原颗粒含量明显较正常对照组大鼠少，局部甚至消失。200和400mg组苦瓜总皂苷组的肝糖原颗粒数量较糖尿病模型组有所增加（P<0.01）,400mg苦瓜总皂苷组的糖原颗粒分布接近正常对照组水平。 5.与正常对照组相比较，2型糖尿病组的GLUT-4蛋白表达量明显减少，二甲双胍组和苦瓜总皂苷100mg组与正常对照组的GLUT-4蛋白表达量无显著性差异，而苦瓜总皂苷200mg和400mg组比正常对照组的GLUT-4蛋白表达量显著增高（P<0.05和P<0.01）。与2型糖尿病模型组比较，各治疗组的GLUT-4蛋白表达量均显著增高（P<0.01），经LSD法比较后发现，各苦瓜总皂苷组间的GLUT-4蛋白表达量有显著性差异（P<0.01）。 论文二： 1.造模后的大鼠体重明显比正常对照组增加（P<0.01），除正常对照组外的各组治疗后大鼠体重均有所降低。与2型糖尿病模型组相比，非诺贝特组体重降低最明显（P<0.01），苦瓜总皂苷治疗各组的体重也不同程度降低，其中200mg组（P<0.05）和400mg组（P<0.01）有统计学意义。 2.200、400mg苦瓜总皂苷组和非诺贝特组大鼠血浆的TG、TC和LDL-C水平低于糖尿病模型组大鼠，HDL-C水平高于糖尿病模型组大鼠（P<0.05或P<0.01），治疗后均恢复至接近正常对照组大鼠水平。 3.苦瓜总皂苷各组的脂肪细胞体积比2型糖尿病模型组相比有所减小，随剂量的增加与正常对照组的细胞体积接近。 4.与正常对照组比，模型组血浆脂联素水平显著降低（P<0.05），瘦素(P<0.05)、抵抗素(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)、IL-6(P<0.01)水平显著升高。进一步做两两比较的LSD检验显示：与模型组相比，200、400mg苦瓜总皂苷组可以明显降低血浆瘦素、抵抗素水平（P<0.05或P<0.01），各剂量苦瓜总皂苷组均可降低TNF-α和IL-6水平（P<0.05或P<0.01），400mg苦瓜总皂苷组可以明显增高血浆脂联素水平（P<0.05），非诺贝特组可明显降低瘦素水平（P<0.05）和升高脂联素水平（P<0.05）。 5.2型糖尿病模型组的PPAR-α与正常对照组无统计学差异（P>0.05）,苦瓜总皂苷组与2型糖尿病模型组相比明显增加（100mg组P<0.05，200、400mg组P<0.01），而且苦瓜总皂苷各组间均有统计学差异（P<0.01），说明PPAR-α的蛋白表达量可以随苦瓜总皂苷剂量的增加而增加。 6.2型糖尿病模型组的PPAR-γ表达量明显比正常对照组低（P<0.01），非诺贝特组和各苦瓜总皂苷组较2型糖尿病模型组明显增加（P<0.01），通过LSD检验发现400mg苦瓜总皂苷组的表达量与非诺贝特组无差异（P>0.05）。 论文三： 1.2型糖尿病模型组的Akt-2和AMPK mRNA表达量较正常对照组明显减低，而各苦瓜总皂苷组和二甲双胍组的表达量较模型组明显增高（P<0.01）。 2.2型糖尿病模型组的PTP-1B、SOCS-3、JNK和PTEN mRNA表达量较正常对照组明显增高，而各苦瓜总皂苷组和二甲双胍组的表达量较模型组明显降低（P<0.01）。SOCS-3和JNK的mRNA表达量随着苦瓜总皂苷的剂量增加而逐渐减低（P<0.01）。 3.2型糖尿病模型组的磷酸化Akt-2（Ser473）的蛋白表达量比正常对照组显著降低，苦瓜总皂苷200、400mg组治疗后的磷酸化Akt-2（Ser473）蛋白表达量比模型组显著增加（P<0.05和P<0.01），而且随着苦瓜总皂苷剂量的增加，磷酸化Akt-2（Ser473）的蛋白表达量逐渐递增。治疗组的磷酸化AMPK（Thr172）表达量均比2型糖尿病模型组显著增高（P<0.01）。 4.2型糖尿病模型组的SOCS-3和JNK的蛋白表达量比正常对照组明显增加(P<0.05和P<0.01)，而治疗后各组SOCS-3和JNK的蛋白表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01)，而且随着苦瓜总皂苷剂量的增加其蛋白表达降低更加明显。各治疗组的PTP-1B和PTEN蛋白表达量与2型糖尿病模型组均无统计学差异。 结论： 1.苦瓜总皂苷有降血糖作用，原因包括：间接保护胰岛β细胞，使肝糖原增加，增强外周组织GLUT-4的蛋白表达进而增加胰岛素敏感性。。 2.苦瓜总皂苷可以降体重、降血脂、减小脂肪细胞体积、调节血浆脂肪因子含量。以上作用可能是通过上调肝脏中的PPAR-α和脂肪组织中的PPAR-γ而完成的。 3.苦瓜总皂苷改善胰岛素抵抗的作用机制可能为：下调PTP-1B、SOCS-3、 JNKmRNA的表达量；上调Akt-2和AMPK的mRNA表达量；下调SOCS-3和JNK的蛋白表达量；上调有活性Akt-2和AMPK的蛋白表达量。 4.以上作用随着苦瓜总皂苷的剂量增加而增强，400mg/(kg d)为最佳剂量。