血清miRNA在过敏性紫癜和紫癜性肾炎中的差异性表达

过敏性紫癜（HSP）是儿童最常见的系统性小血管炎之一，六个月之内极易出现血尿和（或）蛋白尿形成紫癜性肾炎（HSPN）。目前对该疾病的发病机制尚未完全明确。肾活检术是诊断肾脏疾病的金标准，但其有创伤性，并具有一定的风险，不易被患者接受，更不易通过重复肾活检来动态判断治疗效果和评估预后。因此，寻找方便、有效、无创伤性的生物学标志，将极大有利于疾病的诊断和治疗。 微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一组长约18-24nt的内源性非编码RNA，其表达具有组织细胞特异性、发育时序性和进化保守性，在转录后水平调节靶基因的表达，参与细胞增殖、分化、凋亡、脂肪代谢、氧化应激和人类疾病形成等生理和病理过程。 众多研究证实血清中存在稳定表达的miRNA，可抵制RNase的降解，且受极端环境（如高温、极酸或极碱、10次冻融循环）的影响较小，可作为疾病诊断和检测的小侵袭性的生物学标志。本研究旨在应用miRNA基因芯片技术，从血清标本中筛选在过敏性紫癜和紫癜性肾炎中差异表达显著的miRNA，并应用生物信息学预测差异表达miRNA的靶基因，初步探讨miRNA在该疾病中发挥的作用，并为将来的临床应用奠定基础。 研究材料和方法： 1.从正常对照组、过敏性紫癜组和紫癜性肾炎组中各抽出10例患儿血清标本用于芯片筛选实验。 2.采用miRNeasy Mini Ki（tQiagen）提取分离总RNA，使用NanoDrop1000(Nanodrop, Wilmington, Delaware, USA)检测RNA浓度。 3.利用AB TaqMan Human MicroRNA Array（TLDL低密度芯片）进行miRNA的筛选（北京博奥科技公司提供），应用DataAssist2.0软件进行数据分析，找出有差异表达的miRNA。 4.通过逆转录和实时定量PCR技术验证芯片结果。 5.应用TargetScan、PicTar、miRanda数据库对差异表达miRNA进行交集靶基因预测，之后采用Cytoscape v2.8.2软件和DAVID在线数据库进行GO富集分析和KEGG通路分析。 实验结果： 1.所提取的总RNA经过检测符合芯片实验的要求。 2.以基因表达相差2倍为阈值，通过比较过敏性紫癜组和对照组芯片研究结果，发现96个miRNAs差异表达显著，其中7个表达显著上调，89个显著下调；比较紫癜性肾炎组和对照组miRNA的芯片表达结果，发现有68个miRNAs表达呈显著差异，其中11个表达显著上调，57个表达显著下调；进一步利用芯片比较紫癜性肾炎组和过敏性紫癜组miRNA的表达，发现53个miRNAs差异表达显著，其中36个表达显著上调，17个表达显著下调。 3.对过敏性紫癜组和紫癜性肾炎组中差异表达显著的hsa-miR-15b，hsa-let-7d进行相对定量分析，结果显示这些miRNAs的表达与芯片结果表达趋势一致。 4.应用TargetScan、PicTar、miRanda软件对HSP/NC和HSPN/NC中有显著表达差异的miRNA进行靶基因预测，发现有47个miRNAs存在交集靶基因，预测到的靶基因数为617个，而HSPN/HSP中有19个miRNAs存在交集靶基因，预测到的靶基因数为435个。之后，对这两组交集靶基因进行GO富集分析，发现这些靶基因分别富集于224和219个群中（p<0.05），与代谢、生长发育、表达调控等过程有关。KEGG通路分析显示这两组靶基因分别富集于13和11个通路中（p<0.05），与细胞循环分裂、肿瘤形成和信号通路等密切相关。 实验结论： 1.使用芯片从过敏性紫癜中筛选出96个显著表达差异的miRNAs；从紫癜性肾炎中筛选出68个显著表达差异的miRNAs；将紫癜性肾炎和过敏性紫癜比较时，筛选出53个差异表达显著的miRNAs，证实miRNA在过敏性紫癜和紫癜性肾炎中均存在差异性表达。 2.应用RT-PCR对其中2个差异表达显著的miRNAs（hsa-miR-15b、hsa-let-7d）进行相对定量分析，其结果与芯片表达趋势一致。 3.差异表达显著miRNA预测交集靶基因参与细胞增殖分化、信号通路和转录调控等过程，miRNA有可能在过敏性紫癜、紫癜性肾炎的发病中发挥重要的作用，作为疾病新的生物学标志。