猪源益生芽孢杆菌的分离筛选与应用研究

因抗生素滥用而导致的毒性残留、耐药性等问题已引起人们的广泛关注。寻找安全、无毒的替代品迫在眉睫。长期的生产实践及大量研究表明,多种芽孢杆菌对动物正常生理状态的维持和生长繁殖都有重要意义。芽孢杆菌不仅有抑制常见病原菌生长的能力,还能产生多种营养物质,是益生菌菌种开发的重要来源。 本研究依据益生菌筛选的常规方法和芽孢杆菌的判定标准,分离得到一株具有优良益生特性的地衣芽孢杆菌B36,研究了其体外益生性能、应用特点和优化了发酵生产工艺,断奶仔猪饲喂实验验证了其防病促长效果。具体研究结果如下: 1、从健康育肥猪粪便中分离到160株芽孢杆菌,其中菌株B36对家畜养殖业中常见的肠道病原微生物如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O139和肠炎沙门氏菌具有有明显的拮抗能力。经过生理生化实验和16S rDNA序列分析鉴定为地衣芽孢杆菌,进一步研究表明该菌株具有较强的耐受人工胃液、人工肠液和耐胆汁的能力,能够在动物肠道中发挥作用。该菌株芽孢具有一定的耐热性,处理温度低于80℃时,芽孢存活率保持100%,但100℃处理15 min后,存活率为5.5%。 菌株B36对常用的多种抗生素要具有很高的敏感性,在供试的24种抗生素中,只有多粘菌素B和杆菌肽对B36的抑制效果较弱,表明菌株不含有耐药性质粒,不会在动物肠道中的微生物之间造成抗生素抗性的水平转移。 2、通过对菌株抗菌物质的纯化和理化性质分析发现,地衣芽孢杆菌B36产生小分子的蛋白质类细菌素,表现出广谱抗菌作用,对革兰氏阳性细菌都表现出强烈的抗菌活性,对部分革兰氏阴性细菌也表现出抗菌能力,而对酵母和霉菌等真核微生物没有抑制。细菌素具有良好的热稳定性和酸碱稳定性,100℃处理30 min对活性没有影响,115℃处理30 min活性损失75%,121℃处理30 min活性全部丧失;在pH 4-10的范围内活性没有变化。经过有机溶剂处理后的细菌素活性没有损失。细菌素对常见蛋白酶也有抗性,仅对蛋白酶K敏感,作用1 h后活性下降到25%。经过硫酸铵沉淀和葡聚糖凝胶SuperdexTMG-75层析纯化,质谱分析结果显示细菌素的分子量为1422 Da。 3、通过单因素实验和正交设计得到地衣芽孢杆菌B36的固体发酵优化培养基为麸皮700 g,稻草粉300 g,添加葡萄糖40 g/kg,蛋白胨20 g/kg,酵母抽提物20 g/kg,KH2PO4 10 g/kg,生石灰5 g/kg,调节初始含水量65%,37℃静置发酵48 h芽孢产量可以达到1.73×1011CFU/g。 采用上述优化条件,一种简单实用、新型的网袋式生物反应器（Φ120×800 mm）被用于地衣芽孢杆菌固体发酵中试生产,芽孢产量可达到1.2×1011CFU/g,同浅盘式生物反应器相比节约培养空间,具有更高的生产效率。 4、应用Plackett-Burman实验设计,对影响地衣芽孢杆菌B36液体发酵产生芽孢的诸多因子进行了评价,筛选出了影响发酵产抗菌肽的主要内在因素。在Plackea-Burman实验的基础上,通过响应曲面法对主要影响因子进行优化与评价,并能得到影响地衣芽孢杆菌B36发酵产芽孢的二次多项数学模型,并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验。通过对该模型进行求导和解逆矩阵可知,优化后的培养基配方为:玉米淀粉46.6 g/L,蛋白胨3.8 g/L,豆粕粉21.3 g/L,（NH4）2SO4 1.9g/L和CaCO3 2.4·g/L,相应的芽孢产量预测值为Y=8.9×10～9 CFU/mL。采用优化的培养基进行验证试验,地衣芽孢杆菌最终芽孢浓度可以达到9×10～9 CFU/mL,而50 L发酵罐放大试验培养结束时的芽孢产量可以达到1.3×1010 CFU/mL。 5、试验选择21±3日龄长大二元杂交断奶仔猪120头,随机分为5组,比较研究了不同添加水平的地衣芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生产性能的影响。结果表明,添加地衣芽孢杆菌制剂可以显著增加断奶仔猪的平均日增重,降低耗料增重比,同时能够预防仔猪腹泻、提高仔猪成活率和改善饲养环境。