灵芝多糖的硫酸化修饰及其衍生物抗肿瘤活性的初步研究

本论文从液体深层培养的灵芝发酵液提取出不同灵芝多糖为多糖母体,进行硫酸化修饰研究。以制备高活性的抗肿瘤、调节免疫功能的多糖衍生物为目的,研究了采用氨基磺酸对灵芝多糖进行硫酸酯化的新工艺,以替代国内广泛使用的氯磺酸-吡啶法,评价了硫酸化灵芝多糖衍生物的抗肿瘤活性,考察了硫酸化修饰对灵芝多糖活性的影响,同时探讨了硫酸化灵芝多糖有效成分的构效关系。 采用高压破碎的方式,对灵芝菌丝体进行细胞破碎使胞内多糖类物质释放出来,提高多糖得率。采用响应面分析法,得出胞内多糖提取的优化条件为:温度95℃,提取时间3.5h,菌体量与水的质量比1:2,此条件下胞内粗多糖的得率为11.56mg/g菌丝体干重。 对水提后的菌丝残渣进行碱液提取,确定碱提多糖的最适提取工艺:提取温度65℃、提取时间为4h、料碱比(质量体积比)为1:4、碱液浓度O.5 mol/L,所得碱提水溶性多糖得率为93.5mg/g菌丝体干重。 采用超滤浓缩醇沉法以改进多糖的提取工艺,提高多糖品质。考察了超滤浓缩灵芝发酵液的条件:截留分子量10000,料液稀释2倍,压差0.2Mpa;与传统减压热浓缩醇沉法相比,其多糖含量、多糖得率均高于后者,超滤浓缩醇沉法提取的灵芝体多糖的OH清除率高于减压浓缩醇沉法,多糖品质得到提高。 从高通量筛选活性物质的角度出发,借鉴组合化学合成的思路,采用氨基磺酸法及S03-Pyr复合物法对精制灵芝胞外混合多糖进行结构修饰,以取代目前国内广泛使用的C1S03H-Pyr法。较为详细的研究了影响灵芝胞外多糖硫酸化的因素,并确定硫酸化的优化反应条件为: 氨基磺酸法:物料比1:2.5、反应温度90℃、时间2h、料溶比(g:ml)l:50,产物取代度1.46;三氧化硫-吡啶复合物法的最优工艺为:物料比l:2、反应温度80℃、时间2h、料溶比(g:ml)1:40,产物取代度1.53。 对灵芝胞内水提多糖硫酸化研究表明,物料比、反应时间、反应温度和料溶比是影响灵芝胞内水提多糖的硫酸化修饰的重要因素,得到修饰的最佳条件为:物料比1:3,反应时间6h,反应温度80℃,料溶比(g:ml)1:60,在此条件下,硫酸化产物的取代度为0.91;利用这一工艺条件用于灵芝碱提水溶性多糖的硫酸化修饰,硫酸化产物取代度为0.71;琼脂糖电泳显示,硫酸化胞内水提多糖、硫酸化碱提水溶性多糖都可被甲苯胺蓝染色且着色较深;红外光谱分别在1260cm-1、810 cm-1左右都有硫酸酯键的特征吸收峰,说明这两种多糖已分别形成硫酸酯。 对灵芝碱提水溶性多糖硫酸酯的组成进行了初步研究,其单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,比例为48:51:10:25:14。其糖链中五碳糖的比例