MicroRNAs在冠心病血瘀证中的分子机制研究

目的：MicroRNAs (miRNAs)具有调控细胞分化、增殖、凋亡的功能,与心血管疾病密切相关。本研究使用TaqMan低密度芯片(TLDA)从冠心病血瘀证24h大鼠模型心脏组织中筛选差异表达的miRNAs,采用生物信息学分析的手段对差异表达的miRNAs进行生物信息学分析,并构建miRNAs与Gene Ontology (GO)、Pathway间的相互调控网络。分析结果发现,凋亡通路仅被microRNA-384-5p (miR-384-5p)调控。因此,本研究旨在确定miR-384-5p在大鼠冠心病血瘀证中的作用及机制。 方法：1.构建冠心病血瘀证24h大鼠模型,通过基因芯片技术筛选出差异表达的miRNAs;2.采用生物信息学分析的手段,对差异表达的miRNAs进行Gene、 GO、Pathway等生物信息学分析,并构建miRNA-Gene-network、 miRNA-GO-network、miRNA-Pathway-network及Pathway-Pathway-network;3.采用qRT-PCR手段对凋亡通路相关的具有显著意义的靶基因(PIK3CD,PPP3CA, PPP3CB, PPP3R1, CASP3及IL1A)进行验证；4.构建过表达miR-384-5p及miR-384-5p抑制剂的H9c2细胞模型,通过MTT、Western Blot等技术在细胞水平上确定miR-384-5p对H9c2细胞凋亡的影响；5.通过双荧光素酶报告基因分析确定miR-384-5p的靶基因；6.构建过表达miR-384-5p及miR-384-5p抑制剂的H9c2细胞模型,通过Western Blot技术在细胞水平上确定miR-384-5p对其靶基因的影响。 结果：1.基因芯片筛选结果显示,冠心病血瘀证大鼠的心脏组织中16个miRNAs的表达有显著性变化,其中12个上调,4个下调；2.生物信息学手段构建了miRNA-Gene-network、miRNA-GO-network、miRNA-Pathway-network及Pathway-Pathway-network;3.qRT-PCR进一步验证了PIK3CD, PPP3CA, PPP3CB, PPP3R1, CASP3及IL1A的表达,发现PIK3CD, PPP3CA, PPP3R1, CASP3及IL1A的表达均显著上调,与信息分析结果相符合,PIK3CB表达下调,其信息分析结果为假阳性；4.MiR-384-5p可以上调H9c2细胞cleaved caspase3的表达,相反miR-384-5p抑制剂可以下调其表达,揭示了miR-384-5p可以调节凋亡通路；5.MiR-384-5p抑制H9c2细胞活力,而miR-384-5p抑制剂可以促进H9c2细胞活力,说明miR-384-5p的表达下调可以提高H9c2细胞活力；6.MiR-384-5p抑制剂促使H9c2细胞PIK3CD蛋白表达显著上调；7.无论是在模型大鼠心脏组织还是缺氧的H9c2细胞中,miR-384-5p的表达水平均显著下调,并且PIK3CD蛋白的表达水平均显著上调；8.双荧光素酶报告基因分析结果显示,miR-384-5p可与PIK3CD3'-UTR区域结合,验证了二者间的靶基因关系。 结论：通过上述研究结果,可以得出结论：大鼠心肌细胞miR-384-5p可以作为一种保护因子,通过下调其表达,靶向调节PIK3CD,在心脏保护过程中起到重要作用。