葛根素对经IL-1β诱导的大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的： 本实验应用细胞及分子生物学技术,通过研究葛根素对经IL-1β诱导的大鼠软骨细胞中II型胶原的影响,探讨其调节软骨细胞增殖,保护软骨细胞,防治骨关节炎的作用机制,为临床中使用中药葛根治疗骨关节疾病提供实验基础与理论依据。 方法： 1.软骨细胞体外培养体系的建立与鉴定：原代细胞应用联合酶消化法从4周龄SD大鼠关节软骨获取,并以倒置显微镜下的形态学表现及甲苯胺蓝染色进行鉴定； 2.MTT法检测不同浓度的IL-1β对大鼠软骨细胞的影响,筛选适宜的诱导浓度； 3.MTT法检测不同浓度的葛根素对大鼠软骨细胞增殖的影响,筛选最佳干预浓度； 4.采用RT-PCR观察葛根素对IL-1p诱导后软骨细胞COL-II的基因表达的影响； 5. Western Blot检测葛根素对IL-1p诱导后软骨细胞COL-II的蛋白表达的影响。结果： 1.采用联合酶消化方法建立大鼠软骨细胞体外培养体系,经倒置显微镜下形态学观察及甲苯胺蓝染色鉴定,与甲苯胺蓝染色呈异染,确认分离培养的是软骨细胞,软骨细胞培养传3代以内可以保持表型的稳定。 2.关于不同浓度IL-1β诱导后对软骨细胞增殖抑制的变化,以10ng/mlIL-1β诱导48h时对软骨细胞增殖的抑制作用最强。对软骨细胞增殖影响的观察显示：葛根素50、100、200(μmol/L均可促进正常培养软骨细胞的增殖,且增殖效应随药物浓度的增加而递增,在第48h时,对于正常培养的软骨细胞,200[μmol/L葛根素组促进软骨细胞的增殖作用最佳,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。 3.RT-PCR结果显示：四组的mRNA扩增产物中都能看到预期长度的Ⅱ型胶原特异性条带。经IL-1β干预组表达明显减弱,与正常组相比有显著性差异(P<0.05)；Pue组表达明显增强,与正常组、10ng/ml IL-1β组相比有显著性差异(P<0.05);10ng/mL IL-1β+200μmol/LPue组与10ng/mllL-1β组相比表达明显增强,有显著性差异(P<0.05),与正常组mRNA表达无显著性差异(P>0.05)。 4.Western Blot结果显示：正常情况下,软骨细胞中表达COL-2蛋白,而加入10ng/mL IL-1β后,COL-II蛋白表达明显减弱,其差别具有显著性意义(P<0.05)；而200μmol/LPue组能显著上调COL-Ⅱ蛋白表达(P<0.05)。加入200μmol/LPue干预经10ng/mL IL-1β诱导后的大鼠软骨细胞可显著上调被抑制的COL-II蛋白表达,与10ng/mL IL-1β组比较有显著性差异(P<0.05),而与正常组的蛋白表达无明显差异(P>0.05)。结论： 1.IL-1p能够抑制正常培养的大鼠软骨细胞的增殖,且与剂量呈正相关。 2.葛根素能够促进正常培养的大鼠软骨细胞的增殖,且与剂量呈正相关。 3.葛根素能够有效阻止IL-1β对大鼠软骨细胞合成的Ⅱ型胶原在基因表达和蛋白表达的抑制作用。这可能是葛根素有效保护软骨细胞,抵御炎症因子侵蚀,防治骨关节疾病的机制之一。