一、目的
建立单叶铁线莲总皂苷(Total saponins of Radix Clematidis Henryi, TsCH) TsCH的含量测定方法,研究适宜TsCH提取和纯化的工艺条件,考察TsCH的抗炎活性及作用机制,充分利用单叶铁线莲资源,开发以TsCH为主要成分治疗类风湿关节炎的中药新药。
二、方法
l.TsCH的含量测定
选用齐墩果酸为对照品,采用比色法,以5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸为显色剂,在550nm处测定吸光度。以齐墩果酸的量(mg)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标,制作标准曲线,计算得回归方程,进行方法学考察。
2.TsCH微波提取工艺
以TsCH转移率为指标,将微波提取法与加热回流提取法及超声提取法进行比较；在单因素实验的基础上,运用正交实验设计,筛选最佳微波提取工艺。
3.TsCH的纯化工艺
采用静态吸附-解吸和动态吸附-洗脱考察相结合的方法,筛选5种不同性质的大孔树脂；根据筛选出来的树脂进行动态吸附洗脱参数的考察。
4.TsCH对类风湿关节炎大鼠作用的考察
雌性SD大鼠48只,随机分为5组：正常对照组,模型对照组,阳性对照(甲氨蝶呤,1 mg·kg-1·w-1)组,TsCH高、低剂量组(150、50mg·kg-1·d-1)。除正常对照组外,其余注射Ⅱ型胶原造模。灌胃给药,持续5周,观察动物一般情况及体重,测定足趾容积和厚度。5周后处死动物,腹主动脉采血测定血清中免疫球蛋白G (IgG)、白介素-1β(IL1-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量；取大鼠踝关节组织切片,检查关节组织病理学。
三、结果
l.TsCH的含量测定
所得回归方程为Y=3.5913X+0.0077,相关系数R2=0.9994,线性范围0.036～0.216 mg。以此计算TsCH的含量。方法学实验结果显示,显色在120min内吸收值稳定,RSD为1.97%,精密度和重复性良好,RSD分别1.04%和3.11%；平均回收率为97.90%(n=9), RSD为2.08%。
2.TsCH微波提取工艺
结果表明,以70%乙醇为提取溶剂,微波功率300W,料液比1：26,提取3次,每次提取6 min,TsCH的转移率可达95%左右。
3.TsCH的纯化工艺
根据静态吸附、洗脱实验初步确立了D-101型大孔树脂为分离TsCH的树脂,动态考察所得纯化工艺参数为：上样浓度为0.2 g生药·mL-1, pH值为5,以1 BV/h的流速上样,4 BV蒸馏水2 BV/h的流速洗脱杂质,4 BV 70%乙醇以2 BV/h的流速洗脱总皂苷。研究结果表明,未纯化前总固物中总皂苷的含量为29.95%,纯化后总固物中的TsCH含量为71.56%,精制度达238.92%,转移率达到86.03%。
4.TsCH对类风湿关节炎大鼠作用的考察
观察TsCH对Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠的影响。结果发现,注射Ⅱ型胶原两次,21天后造模成功。与模型组相比,TsCH能明显降低关节炎指数评分,减小足趾容积,足趾厚度有降低趋势；能降低血清中IgG、IL1-β、TNF-α水平；关节组织病理学检查显示TsCH对减轻滑膜增生和炎细胞浸润表现出了较好的作用趋势；TsCH对RA大鼠的疗效具有剂量依赖性关系。
四、结论
1本文研究确定的TsCH的制备工艺方法效率高、选择性好,为TsCH的工业化生产提供了参考。
2通过Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠模型动物实验表明TsCH对II型胶原诱导型关节炎大鼠能缓解症状和改善病变,对类风湿关节炎有防治作用。
