第一部分阴虚“上火”蛋白质生物学标志物的筛选与鉴定及知柏地黄丸干预的实验研究研究背景:知柏地黄丸是干预阴虚“上火”的经典中药方剂,应用在中医临床实践已有上千年的历史,但是其干预机制尚未明确。本研究旨在探讨阴虚“上火”血清蛋白标志物以及知柏地黄丸干预阴虚“上火”的分子生物学机制。研究方法:我们用热性中药附子、干姜、肉桂对大鼠灌胃诱导阴虚“上火”动物模型,然后用知柏地黄丸进行干预治疗,收集大鼠的血清样本,并对重要脏器和体重进行测量。应用蛋白组学iTRAQ-2DLC-MS/MS技术分析大鼠血清样本,筛选知柏地黄丸干预前后血清差异表达蛋白质,结合生物信息学分析手段探索阴虚“上火”血清蛋白标志物以及知柏地黄丸干预阴虚“上火”大鼠的作用机制。研究结果:阴虚“上火”大鼠体重显著低于正常组,知柏地黄丸干预后,大鼠体重回升。阴虚“上火”大鼠胸腺指数显著高于正常组,知柏地黄丸干预后,胸腺指数降低。在蛋白组学实验中,知柏地黄丸干预前后,大鼠血清中共出现71个差异表达的蛋白质,其中10蛋白表达显著上调,61个蛋白表达显著下调。GO分析显示这些差异蛋白主要参与免疫反应,KEGG信号通路富集分析提示差异蛋白集中在补体与凝血途径。我们用酶联免疫实验检测补体与凝血途径中差异蛋白,发现C9、C5、Fga、Fgb、vWF、Fgg表达水平在阴虚“上火”大鼠血清中显著变化,知柏地黄丸干预后,C9、C5、Fga、Fgb、Fgg有恢复趋势,说明知柏地黄丸可通过调节补体和凝血通路干预阴虚“上火”。而且C9和Fgg在知柏地黄丸干预后的恢复具有显著性差异,可作为阴虚“上火”潜在生物学标志物。结论:我们的研究筛选并鉴定了阴虚“上火”大鼠蛋白标志物,并为揭示知柏地黄丸干预阴虚“上火”的作用机制提供了科学依据。阴虚“上火”状态下补体与凝血途径发生紊乱,知柏地黄丸清热泻火、滋阴降燥功效可能通过促进补体激活途径、增强清除病原体能力、缓解炎症反应;活血化瘀功效可能通过对凝血反应的抑制作用实现。第二部分人体阴虚“上火”血清miRNA标志物的筛选与鉴定研究背景:人体阴虚“上火”是常见的一种亚健康状态,可能由体质因素、精神刺激、疲劳过度或不良生活习惯等多种因素引起的身体机能失衡。阴虚“上火”发生的生物学机制不明,而且临床缺乏客观量化的诊断指标,导致阴虚“上火”不能及时治疗,常发展为病理状态。因此应用现代生物学技术揭示阴虚“上火”的生物学本质,寻找生物学标志物,使其得到客观、定量的描述尤为迫切。研究方法:本研究应用蛋白组学iTRAQ-2D LC-MS/MS和转录组学Solexa测序技术,研究85例阴虚“上火”口疮患者和56例平和质健康对照者血清蛋白和miRNA表达谱,并用生物信息学方法对差异表达的蛋白和miRNA进行生物学功能和信号通路的富集分析。进一步用荧光定量PCR筛选阴虚“上火”的血清miRNA生物学标志物,并用ROC曲线构建阴虚“上火”的潜在诊断模型。研究结果:蛋白组学iTRAQ实验中,我们发现阴虚“上火”人群血清中存在120个差异表达的蛋白质,生物学功能和信号通路的富集分析提示,这些差异蛋白主要集中在补体与凝血通路,参与补体激活和凝血反应。转录组学实验发现阴虚“上火”人群血清中存在41个差异表达的miRNAs。蛋白组学和转录组学关联分析显示12个差异miRNAs与补体凝血途径中的差异蛋白存在调控关系。我们用荧光定量PCR对差异miRNA进行大样本量验证,筛选并鉴定了 5个miRNA在阴虚“上火”者血清中显著降低。其中 3 个 miRNA,hsa-miR-142-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-27b-3p用ROC构建潜在诊断模型的组合物,灵敏性和特异性分别达到了95.6%,100%,可用作检测阴虚“上火”的潜在生物学标志物。研究结论:(1)应用蛋白组学和转录组学技术筛选阴虚“上火”人群血清差异蛋白质和差异miRNAs,并通过生物信息分析发现阴虚“上火”者血清差异蛋白主要集中在补体与凝血通路,得出阴虚“上火”人群补体与凝血通路发生紊乱。(2)hsa-miR-142-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-27b-3p 组合物可作为阴虚“上火”潜在诊断模型,为临床诊断阴虚“上火”提供了潜在诊断标志物,为中医疾病诊断的定量化、客观化提供了新的思路。
