川陈皮素对实验性脑梗死大鼠脑保护作用及其对p-Akt、p-CREB、BDNF、Bcl-2和Claudin-5调节作用的实验研究

目的：脑血管病是导致人类死亡和后天性残疾的首位原因,其中以缺血性脑血管病最为常见。脑缺血是由供应脑的血液局部减少或完全阻断诱发,但其发病机制十分复杂,主要包括兴奋性谷氨酸毒性、钙超载、氧化应激、一氧化氮生成和细胞炎症反应等,这是一个复杂的相互依存的病理级联反应,最终加速脑梗死缺血半暗带的细胞死亡。尽管静脉内溶栓目前批准用于治疗急性缺血性中风但由于其狭窄的治疗窗和安全问题,其临床应用仍然受到限制。因此,探索新型治疗药物成为当前一个主要的挑战。 Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是磷脂酰肌醇-3羟基激酶(PI3-K)下游的关键效应分子。Akt激活后磷酸化CREB的Ser133位点,导致了促存活靶基因的合成,如BDNF和Bcl-2。Akt/CREB信号通路可能是治疗缺血性脑损伤的一个目标。 川陈皮素(Hobiletin, NOB)属于多甲氧基黄酮类,主要提取于传统中药陈皮,并且广泛存在于柑橘类水果的果皮中。在传统中医中,陈皮用来缓解胃部不适、呼吸道炎症综合征和癣感染。近代研究显示川陈皮素具有广泛的益于健康的生理作用,除了抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、降低血糖、肝保护等作用以外,还具有神经营养的作用。但有关川陈皮素在脑梗死急性期的神经保护作用及其机制的研究却很少。 本实验成功建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,并运用此模型进行：①应用川陈皮素后,观察其对神经功能缺损评分、脑含水量、脑梗死体积的影响,探索其脑保护作用；②应用川陈皮素后,测定缺血组织的p-Akt、 p-CREB、BDNF、Bcl-2和claudin-5的含量变化,从而探讨川陈皮素脑保护作用的可能机制,为临床治疗提供更为有利的理论依据。 方法：采用健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,按照改良的Longa线栓法建立右侧pMCAO动物模型。实验动物随机分为假手术组(Sham)、单梗组(MCAO)、溶剂对照组(Vehicle)、川陈皮素低剂量组(MCAO+NOB10mg/kg,NOB-L)、川陈皮素高剂量组(MCAO+NOB25mg/kg,NOB-H)。药物干预组动物于造模前连续腹腔给药3天,每天1次,造模后立即再给一次药。Sham组和Vehicle组同样方法但给予等容量0.05%吐温-80。术后24小时采用改良的Longa评分法对大鼠进行神经功能缺损评分,评分过后将其断头处死,留取病变侧脑组织采用干湿重法测定脑含水量,用2%的2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法测定脑梗死体积,用免疫组织化学、免疫印记(Western blot)和逆转录定量聚合酶链反应(Reverse Transcription-qPolymerase Chain Reaction, RT-qPCR)测定Akt、CREB、BDNF、Bcl-2和claudin-5的活性。 结果： 1神经功能评分：假手术组未出现神经功能缺损,而单梗组、溶剂对照组、川陈皮素低剂量组和川陈皮素高剂量组大鼠均出现不同程度的左侧肢体瘫痪。与溶剂对照组相比,川陈皮素高剂量组的神经功能评分明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。而川陈皮素低剂量组与溶剂对照组相比,神经功能评分无明显差异。 2脑组织含水量测定：假手术组右侧脑组织含水量为78.46±0.34%,脑梗塞后脑组织含水量明显升高,溶剂对照组病变侧脑组织含水量为85.38±0.52%,高剂量川陈皮素可明显降低脑组织含水量(83.38±0.41%),与溶剂对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。尽管低剂量组减少脑组织含水量(84.71±0.33%),但差异并没有统计学意义(P>0.05)。 3梗死体积的测定。假手术组组无梗死灶。与溶剂对照组(46.12±0.94%)相比,川陈皮素低剂量组(39.84±1.77%)和高剂量组(36.07±2.32%)梗死体积都明显减小,差异有统计学意义(P<0.05)。 4川陈皮素对p-Akt、p-CREB、BDNF、Bcl-2和claudin-5表达的影响：与溶剂对照组相比,川陈皮素高剂量组中p-Akt、BDNF、Bcl-2和claudin-5在蛋白水平表达明显升高(P<0.05),川陈皮素低剂量组和高剂量组都增加了p-CREB的蛋白表达(P<0.05),并且低剂量组比高剂量组升高的更明显。在mRNA水平,与溶剂对照组相比,川陈皮素高剂量组增加了Akt、BDNF和claudin-5的表达,(P<0.05),而川陈皮素低剂量组和高剂量组都增加了Bcl-2和p-CREB的基因表达(P<0.05)。 结论：川陈皮素对局灶性脑缺血具有神经保护作用,可以改善神经功能缺损症状,减轻脑水肿,减少脑梗死体积。其保护作用可能与激活Akt/CREB通路,上调BDNF、Bcl-2和claudin-5的表达有关。