使用飞行质谱结合PCR技术及第二代测序技术检测乳腺癌与病毒相关性的研究

背景： 乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型，每年全世界估计有138万新发病例以及超过45万人死亡[1]。众所周知，乳腺癌是一种多因素的疾病，其中包括遗传，激素和环境因素等。近年有研究报道5%至10%的乳腺癌病例是由遗传基因突变引起的[2,3]，然而大多数乳腺癌的病因仍然是未知的。某些病毒，细菌和寄生虫引起的感染已被确认为癌症的主要原因，据统计人类癌症的16%与这些微生物相关[4]。因此，接种疫苗将可能有效地预防这些癌症。根据国际癌症研究机构（InternationalAgency forresearch on Cancer，IARC）报告，爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr Virus，EBV），乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV），丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV），卡波西肉瘤疱疹病毒（Kaposi’s Sarcoma Herpes Virus，KSHV），人类免疫缺陷病毒类型1（Human Immunodeficiency Virus Type1，HIV），人乳头状瘤病毒（HumanPapilloma Virus，HPV），人类T细胞淋巴性病毒类型1（Human T-cell LymphotrophicVirus Type-1，HTLV），幽门螺旋杆菌，华支睾吸虫，泰国肝吸虫，埃及血吸虫都是人类致癌微生物[5]。例如，感染慢性乙型或丙型肝炎病毒会导致肝细胞癌。慢性丙型肝炎病毒感染也可引起非霍奇金淋巴瘤，尤其是B-细胞淋巴瘤。这些发现为预防和治疗癌症提供了一个重要研究思路。 自从Bittner发现小鼠乳腺肿瘤病毒（Mouse Mammary Tumor Virus，MMTV）可引起小鼠乳腺肿瘤以来，哪些病毒与乳腺癌有关，困扰了研究者几十年。许多研究表明，HPV，EBV，MMTV，猿猴病毒40（SV40），KSHV可能和乳腺癌有一定联系[7]。 在乳腺癌的研究中，HPV感染的致病作用仍存在争议。有研究报道，大约有20%的人乳腺癌组织中HPV高危亚型呈阳性，尤其是HPV16，18和33[6]。相反，其它研究在乳腺癌组织中没有检测到任何HPV亚型[7]。究其原因，我们认为多可能与不同研究阶段的技术手段和水平相关。 目的： 本研究拟通过近年新兴和快速发展的飞行质谱（MALDI-TOF）结合多重PCR检测的质谱法（PCR-MS）及第二代基因测序技术（NGS）来检测乳腺癌样本中是否有病毒存在，从而发现乳腺癌可能的发病机制。 方法和结果： PCR-MS在微生物检测和确认中是一个功能强大的工具，它可以同时检测多种感染。最近，课题组发明了一个新的高精确度的HPV基因分型检测方法（MS-HPV），即使用PCR-MS检测致癌的30种HPV亚型（E6和L1），这种方法可以避免质谱检测中常见的假阴性问题，使目标只有一个（E6或L1）。PCR-MS方法防止PCR遗留污染和多探针之间的交互污染[8]。 在本实验中，首先使用PCR-MS方法对135例石蜡固定宫颈癌样本进行检测，同样也使用常规PCR+测序技术和商业HPV检测试剂盒对所有样本进行检测，然后与结果进行比对。结果发现新方法检测单一HPV感染比商业化试剂盒方法灵敏度高（97%；90.4%），在多重感染的检出中，新方法和商业化试剂盒方法的检出率分别为（55.6%；25.2%）。通过PCR复检，新方法的阳性率达87%(65/75)。 使用MS-PCR方法在乳腺癌，乳腺良性肿瘤及健康志愿者样本中检测HPV，SV40，BKPyV，JCPyV，WUPyV，KIPyV，MCPyV，EBV和KSHV病毒的检出率。阳性结果都通过PCR和DNA测序证实。结果为：在乳腺癌中EBV，MCPyV以及HPV检出率分别为：74.0%，14%和2%；在乳腺良性病变中EBV和MCPyV检出率分别为：32%和2%。结果表明EBV和MCPyV在乳腺癌中的感染率较乳腺良性病变有明显统计学意义(EBV：74.0%vs.32.0%，p <0.0001；MCPyV：14.0%vs.2.0%，p=0.02)。然而在外周血中这两种病毒并没有统计学意义。实验结果证实EBV和MCPyV在乳腺癌中的检出率明显高于乳腺良性疾病，但这两种病毒是否为乳腺癌的高危诱因还需进一步研究。 使用NGS联合高性能生物信息算法，检测8例乳腺癌样本中的病毒。研究发现大多数乳腺癌标本中都检出HPV16，部分标本有HBV感染。结果为：HPV在外周血，转移淋巴结，癌组织和癌旁组织中的检出率分别为：5/8，7/8，7/8，7/8。HBV在外周血，转移淋巴结，癌组织和癌旁组织中的检出率分别为：7/8，8/8，7/8，8/8。四个组织中HPV平均丰度的顺序从高到低依次为：外周血，癌旁组织，癌组织，转移淋巴结。四个组织中HBV平均丰度的顺序从高到低依次为：外周血，转移淋巴结，癌旁组织，肿瘤组织。此外，还对病毒感染进行定量分析，包括丰度，覆盖度和深度。但病毒是通过何种机制导致乳腺癌发生亦需要进一步深入研究。 结论： 乳腺癌中存在多种病毒感染，但它在乳腺癌发病机制中的具体作用还有待深入研究。