脆壁克鲁维酵母（KluyveromycesFragilis）LFS-8611β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

低聚半乳糖是由2-10个半乳糖基和葡萄糖基通过糖苷键连接的碳水化合物。商业化的低聚半乳糖以乳糖为底物,利用微生物β-D-半乳糖苷酶催化半乳糖基转移反应来生产。低聚半乳糖属于非消化性低聚糖,具有低甜度、低热能、低致龋齿性、选择性的促进人体肠道内有益菌增殖等生理学性质,在食品领域的应用潜力很大。本论文以提高β-D-半乳糖苷酶催化合成的低聚半乳糖的产率为目标,对产β-D-半乳糖苷酶的菌株筛选、发酵条件、β-D-半乳糖苷酶的诱导合成、酶的分离纯化及性质、酶法合成低聚半乳糖的过程和产物分离等进行了系统的研究,试验结果表明: 以脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)为出发菌株,甲基磺酸乙酯(EMS)为诱变剂,5-溴-4-氯-3-吲哚-吡喃半乳糖苷(X-gal)作为筛子从诱变后的860个菌落中选育到一株具有较高转苷活力的β-D-半乳糖苷酶高产菌株,菌株编号为脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)LFS-8611。以乳糖为底物,由该菌株产生的β-D-半乳糖苷酶催化合成的低聚半乳糖产率为29.6%,是出发菌株的2.8倍。利用脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)LFS-8611液体发酵生产β-D-半乳糖苷酶的最佳培养基组成为:乳糖质量浓度为12mg/L、氮源质量浓度为16mg/L;最适培养条件为:培养基的初始pH为7.5、摇床转速为200r/min、培养温度25℃。在此最适培养条件下酶活力达到15.8U/mL,较出发菌株酶活力提高了3.0倍。 脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶为诱导酶,半乳糖和乳糖是该酶的诱导物,两者的诱导系数(诱导酶活/非诱导酶活)分别为2.8和1.9。半乳糖诱导该菌株产酶的适宜浓度为10mg/mL,诱导4h酶活力达到最大值18.86U/mL。该酶的生物合成需要诱导物的持续存在,除去诱导物后,诱导作用很快消失。葡萄糖既不阻止该菌株对半乳糖和乳糖的吸收也不抑制半乳糖和乳糖对K. fragilisLFS-8611β-D-半乳糖苷酶的诱导合成。半乳糖对于进入对数生长前、中、后期和稳定期的菌体细胞都具有诱导作用,但对处于对数生长前期的菌体细胞的诱导系数大些。 分别采用常规柱色谱和中压液相色谱两种纯化方法对K. fragilisLFS-8611 β-D-半乳糖苷酶粗酶进行了纯化。采用常规柱色谱,粗酶先后经过(NH4)2SO4分级沉淀、CM-Sepharose CL-6B、DEAE-Sepharose CL-6B、Sephacryl S-200等分离纯化步骤,酶的回收率为16%,纯化倍数为45.8;采用中压液相色谱,粗酶经过Hiprep?16/10 Source TM 30Q强阴离子交换柱和Hioad26/60 Superdex凝胶过滤色谱两步纯化,酶的回收率为 27%,纯化倍数为42。经过上述两种方法纯化的K. fragilisLFS-8611 β-D-半乳糖苷酶在垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上,均呈现一条染色谱带,表明纯化的酶具有较高的纯度。SDS-PAGE电泳结果表明,K. fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶相对分子质量约为60000,Sepharose CL-6B凝胶过滤色谱测定的该酶相对分子质量约为68000。 脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶为中温酶,该酶的最适酶反应温度为45℃,最适pH为7.5, pH稳定范围为7.5-8.0,温度稳定范围为25-40℃,在pH7.5的缓冲液中经温度40℃保温6h后,酶活力几乎没有损失。Pb2+、Cu2+、Zn2+等金属离子及十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)等化合物对该酶具有抑制作用; 该酶水解邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)和乳糖的米氏常数(Km)分别为2.35μmol/mL和0.39μmol/mL,最大反应速率(Vmax)分别为1.41μmol/min和0.188μmol/min。乳糖的水解产物半乳糖抑制K. fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的活力,而葡萄糖对该酶的活力无抑制作用. 以乳糖为底物,K. fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶催化合成的低聚半乳糖主要是三糖。乳糖的起始浓度对合成的低聚半乳糖产量影响最为显著,乳糖起始浓度从110mg/mL增加到660mg/mL,形成的低聚半乳糖的最大含量相应从43mg/mL增加到208mg/mL。该酶催化低聚半乳糖合成的最适酶反应条件为:温度40℃、pH7.0、反应时间20h。在此最适酶反应条件下,以3L 40%(w/w)乳糖溶液为底物,K. fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的产率为34.6%。乳糖的水解产物葡萄糖和半乳糖对低聚半乳糖的合成具有抑制作用。 以乳糖为底物,K. fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶催化乳糖转苷反应后的酶反应液中含有葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖等糖类。此糖类混合物经过Sephadex G-15凝胶过滤色谱和DTF-02树脂连续两步分离后得到的低聚半乳糖在高效液相色谱(HPLC)上为一个单峰,表明低聚半乳糖达到了较高的纯度。高效液相电喷雾电离质谱联用(HPLC/ESI-MS)分析结果表明:脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶催化合成的低聚半乳糖为三糖和四糖。气相色谱分析结果表明:低聚半乳三糖是由两分子半乳糖和一分子葡萄糖组成。